肾小球系膜细胞结缔组织生长因子在高氨基酸环境下表达及氨基胍的抑制效应

目的:检测高氨基酸环境下肾小球系膜细胞结缔组织生长因子表达的变化,以及糖基化终末产物抑制剂氨基胍对其的干预调节。方法:实验于2005-04/10在同济医院肾病实验室完成。①大鼠肾小球系膜细胞由上海长征医院梅长林教授惠赠;复方氨基酸注射液(商品名:乐凡命,华瑞制药有限公司,批号041203701);L-精氨酸(上海生工生物工程技术服务有限公司,批号0421S04);氨基胍(Germany)。②参照本实验室以往系膜细胞培养的生长曲线,取对数生长期肾小球系膜细胞,接种时细胞密度按1×105常规培养6瓶,目测待铺满培养瓶底60%～80%时,随机数字表法分为3组:低糖组、高氨基酸 低糖组、氨基胍 高氨基酸 低糖组,2瓶/组。③各组在不同培养环境下继续培养。低糖组:5.5mmol/L的普通低糖DMEM培养液;高氨基酸 低糖组:在低糖组基础上加入85g/L的复方氨基酸注射液 2.48mmol/L的L-精氨酸;氨基胍 高氨基酸 低糖组:在高氨基酸 低糖组基础上加入0.5mmol/L的氨基胍。④各组细胞经培养液处理24h后,反转录聚合酶链反应检测结缔组织生长因子mRNA的表达;处理48h后,Western-blot检测结缔组织生长因子蛋白的表达。结缔组织生长因子基因和蛋白的表达检测均在相同的条件下重复3次。结果:①各组细胞经培养液处理24h后结缔组织生长因子mRNA的表达:高氨基酸 低糖组结缔组织生长因子mRNA的表达明显高于低糖组(1.895±0.142,0.564±0.238,P<0.05);氨基胍 高氨基酸 低糖组结缔组织生长因子mRNA水平下降至0.882±0.189,明显低于高氨基酸 低糖组(P<0.05),与低糖组基本相似(P>0.05)。②各组细胞经培养液处理48h后结缔组织生长因子蛋白的表达:高氨基酸 低糖组结缔组织生长因子蛋白的表达明显高于低糖组[(2.125±0.271)×105,(1.125±0.104)×105,P<0.05];当加入糖基化终末产物抑制剂氨基胍后,氨基胍 高氨基酸 低糖组结缔组织生长因子蛋白的表达下降为(1.391±0.193)×105,明显低于高氨基酸 低糖组(P<0.05),与低糖组基本相似(P>0.05)。结论:高氨基酸可使肾小球系膜细胞产生大量结缔组织生长因子,氨基胍可显著抑制其表达,提示高氨基酸诱导的结缔组织生长因子表达增多可能与晚期糖基化终末产物形成有关。     

高氨基酸血症对肾小球系膜细胞结缔组织生长因子表达的影响及与氧化应激的关系

目的研究高氨基酸血症对肾小球系膜细胞结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响,探讨氧化应激在其中的作用。方法大鼠肾小球系膜细胞分为不同培养环境下的对照组(C组)、高氨基酸组(HA组)、维生素E组(HAE组)。培养24h后用荧光染料2',7'-Dichloroluores-cin diacetate(20μmol/L)测定各组细胞内活性氧产物(reactive oxygen specie,ROS)的生成情况从而反应细胞内氧化应激水平,培养24h后采用RT-PCR检测各组CTGF mRNA表达,培养48h后采用Western印迹检测各组CTGF蛋白的表达。结果HA组氧化应激水平、CTGF mRNA及蛋白的表达均明显高于C组(P<0.05);HAE组其氧化应激水平、CTGF mRNA及蛋白表达较HA组明显降低(P<0.05),且与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论高氨基酸血症可使肾小球系膜细胞氧化应激水平升高并产生过多的CTGF,抗氧化剂维生素E可减轻系膜细胞氧化应激及CTGF的表达,提示高氨基酸诱导的CTGF表达增多可能与氧化应激有关。