表达SARS冠状病毒受体人ACE2转基因小鼠的建立

目的:建立表达SARS冠状病毒的功能性受体人ACE2的转基因小鼠.方法:克隆人2型血管紧张素转换酶(hACE2)的cDNA,连入PCAGGS构建转基因表达载体,以显微注射的方法将5.6 kb的转基因片段引入小鼠的受精卵.采用PCR、Southern印迹、RT-PCR、Western印迹、免疫荧光染色的方法对转基因小鼠进行鉴定.结果与结论:获得了在小鼠肺组织中表达有SARS病毒功能性受体hACE2的两个转基因小鼠系,证明了SARS病毒的S蛋白能很好地和转基因小鼠肺组织中表达的hACE2受体结合,这将为SARS的研究提供一种良好的感染动物模型.     

5 L生物反应器中长期灌流培养CHO工程细胞生产rt-PA

目的 :利用 5L反应器培养CHO工程细胞生产重组组织型纤溶酶原激活剂 (recombinanttissueplasminogenactivator ,rt PA)。 方法 :在 5L搅拌式生物反应器中采用Cytopore1多孔微载体和无血清培基DF5S连续灌流培养CHO工程细胞株 4B3。结果 :持续培养达 10 3d ,活细胞密度和rt PA生产水平分别达到 6 .52× 10 6 个细胞 /ml和 1716 1U/ml。细胞培养上清经StreamlineSP离子交换层析和Lysine Sepharose 4B亲和层析两步纯化 ,获得纯度达到 98%的rt PA。SDS PAGE分析表明 ,整个培养过程所生产的rt PA具有较好的质量一致性。产品热原检测合格。结论 :实现高密度长期培养 4B3细胞 ,确定 5L培养工艺 ,为进一步扩大生产规模奠定了基础     

小鼠β-酪蛋白基因的克隆及序列分析

目的：从129Sv小鼠基因组文库中分离克隆β－酪蛋白基因。方法：PCR方法扩增部分β－酪蛋白基因作为探针，用原位杂交和PCR方法从小鼠基因组文库中分离克隆β－酪蛋白基因。结果和结论：通过3轮原位杂交分析，获得了包括小鼠β－酪蛋白全长基因在内的阳性克隆，为进一步构建乳腺特异表达基因打靶载体创造了条件。     

反相高效液相色谱法测定重组人干扰素α1b多剂量注射液中间甲酚含量

目的: 建立测定重组人干扰素α1b多剂量注射液中间甲酚含量的高效液相色谱(HPLC)检测方法,并对方法进行验证。方法: 采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法,选用Venusil, ASB-C18(5μm,4.6mm×150mm)色谱柱,流动相为0.2mol.L_^-1硫酸盐缓冲液(pH=2.3)-乙腈(74﹕26),流速1mL.min_^-1,进样量20μL,检测波长270nm,柱温40℃,等度洗脱。对方法进行专属性、线性、准确度、精密度、重复性、检测限、定量限等一系列验证。结果: 该方法在间甲酚含量为100.0～300.0μg.mL_^-1范围内线性良好,r_²值为1.000。相关辅料及干扰素α1b对间甲酚检测无干扰。该方法检测高、中、低3种浓度9组样品回收率(n=9)在96.2%～101.5%;精密度 RSD(n=9)为0.78%;定量下限为4.3mg.mL_^-1,检测下限为1.4mg.mL_^-1。对 6批次重组人干扰素α1b多剂量注射液中间甲酚含量均在其标示量的90～110%之间,质量合格。结论: 建立的RP-HPLC方法专属性良好,精密度、准确性高,可用于检测重组人干扰素α1b多剂量注射液中的间甲酚含量。     

肠道病毒71型病毒样颗粒在汉逊酵母中的表达

目的应用汉逊酵母表达系统进行肠道病毒71型（EV71）病毒样颗粒（VLP）的表达。方法将经过汉逊酵母密码子优化的人EV71的 P1和3CD基因片段克隆到汉逊酵母表达载体PMV上,获得重组表达质粒PMV-P1-3CD,转化汉逊酵母宿主菌AU0501,PCR方法及稳定传代培养筛选整合P1和3 CD基因的重组菌株。重组菌种接种在含有1％甲醇的培养基中进行诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot检测。挑选优胜表达菌株进行30 L发酵罐发酵培养,发酵产物经过粗略纯化后进行电镜分析。结果筛选获得EV71重组表达菌株;SDS-PAGE检测结果显示在相对分子质量（Mr）为26×103、33×103、35×103处有明显的VP3、VP1、VP0蛋白条带,Mr 大小与预期的目的蛋白大小一致;Western blot检测结果显示表达产物与EV71-VP1单克隆抗体在M r 为33×103处有较为明显的VP1反应条带,表达产物具有良好的免疫反应性;表达菌株发酵表达量可达200 mg/L,电镜分析可见24～30 nm的VLP,且颗粒结构完好。结论应用汉逊酵母表达系统成功表达了EV71 VLP,为今后研制EV71 VLP疫苗奠定基础。     

蛋白质复性技术研究进展

在实验室和工业领域中,快速而廉价地制备目的蛋白的方法对于促进蛋白质科学和工程的研究至关重要。使用基于包涵体的蛋白质表达系统是一种经典的方法,在上游过程中可以获得高产量,但是在下游过程中未正确折叠的蛋白质复性过程通常会导致产量显著降低。最具挑战性的是,蛋白质的复性条件因构象不同各有差异,需要个体化的针对性研究进行反复试验来提高蛋白质终产量。因此,为了将这种麻烦的折叠过程转变为常规的折叠过程,基于新技术和新材料的各种方法应运而生。文章首先简略地概述蛋白质折叠,总结包涵体变性的不同方式,重点对在复性过程中的三种思路进行了综述,并就蛋白质复性方面已报道的热点描述了方法发展背后的概念,以期提供一种通用的复性研究思路。     

重组人组织型纤溶酶原激活剂中细胞残余DNA的检测

采用地高辛标记探针,以核酸分子班点杂交技术检测重组人组织型纤溶酶原激活剂（ｒｔ－ＰＡ）中细胞残余ＤＮＡ的方法。从样品中去掉蛋白提取ＤＮＡ的方法能有效的避免蛋白对检测结果的干扰,其灵敏度和结果都能较好地达到ＷＨＯ的要求。     

产组织型纤溶酶原激活剂CHO工程细胞无血清培基的研究

在对ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）进行优化的基础上,以细胞生长和组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）表达为评价指标,筛选无血清培养基添加成分,建立了由优化ＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）,胰岛素,ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ－６８维生素Ｃ,乙醇胺和微量元素混合液组成的适于产ｔ－ＰＡＣＨＯ工程细胞４Ｂ３生长和ｔ－ＰＡ表达效果均优于相同条件下用含血清培基培养的效果。