超广谱β-内酰胺酶及AmpC酶研究进展

革兰阴性杆菌耐药机制复杂，发展迅速，按照与临床紧密结合的BJM分类，β-内酰胺酶(BLA)中主要为染色体和质粒介导的Ⅰ型AmpC酶和Ⅱ型中的超广谱β-内酰胺酶。随着β-内酰胺类抗生素的广泛应用，菌株产生新的BLA并可引起流行，故其检测受到临床重视。     

艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3融合蛋白诱导表达条件优化及其纯化

目的：优化艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3融合蛋白诱导表达条件,在获得高表达融合蛋白后对其进行纯化,为艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3单克隆抗体的制备奠定基础。方法以诱导前菌液600 nm处的光密度值（OD600）、诱导温度、诱导剂异丙基-β-D巯基半乳糖苷（IPTG）浓度和诱导时间为单变量,分别诱导融合蛋白的表达,在此基础上采用正交试验对融合蛋白的诱导表达条件进行优化,通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳半定量分析融合蛋白的表达量及表达形式,以Western blot对融合蛋白进行鉴定,以GST 亲和层析柱对融合蛋白进行纯化。结果融合蛋白诱导表达的最佳条件为诱导前菌液OD6000．8、IPTG浓度0．6 mmol/L、诱导时间12 h、诱导温度30℃,融合蛋白以可溶性蛋白表达形式为主,经纯化后,融合蛋白纯度超过90％。结论本研究成功优化了艰难梭菌毒素B受体结合区CDB3融合蛋白的诱导表达条件,获得大量表达,并成功对其进行了纯化,为后续单克隆抗体的制备奠定了基础。     

假鼻疽伯克霍尔德菌脓毒症死亡病例1例

类鼻疽病（melioidosis）是由假鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia psudomallei）所致的热带和亚热带地区的一种人兽共患病。因假鼻疽伯克霍尔德菌的高致病性、强抵抗力、易传播、易培养等特性,美国疾病预防控制中心将其列为B类生物恐怖剂;临床上有急性败血症型、亚急性、慢性及亚临床4种表型。急性患者可有高热、衰竭等全身症状;病菌进入血流,可形成菌血症及内脏脓肿,最后常因脓毒症死亡。慢性患者全身症状不定,可有皮肤及皮下溃疡,常类似空洞肺结核表现,其潜伏期可达数年。最近,我们从1例糖尿病肺部感染、腋窝软组织感染患者血液、骨髓等标本中分离出假鼻疽伯克霍尔德菌,现报告如下。     

住院腹泻患者艰难梭菌检测与分析

目的通过对住院腹泻患者粪便标本中的艰难梭菌进行筛查和不同时期检出率的比较,了解某院腹泻患者艰难梭菌的感染情况。方法收集该院2009年2—12月和2011年4—7月住院腹泻患者粪便标本106份,进行厌氧培养和API鉴定,对培养鉴定获得的菌株应用聚合酶链反应（PCR）扩增法进行A、B毒素及二元毒素基因检测;酶联荧光免疫法检测毒素A/B。结果 106份标本中,厌氧培养艰难梭菌阳性16株（15.09%）。16株菌经PCR扩增,A、B毒素均阳性,二元毒素均阴性。直接毒素A/B检测阳性率为12.26%（13/106）,与厌氧培养阳性率比较,差异无统计学意义（χ^20.16,P〉0.05）。2009年2—12月和2011年4—7月两个时期的标本厌氧培养艰难梭菌阳性率分别为22.81%（13/57）、6.12%（3/49）,两者比较,差异有统计学意义（χ^25.73,P〈0.05）;毒素A/B检出率分别为17.54%（10/57）、6.12%（3/49）,差异无统计学意义（χ^23.18,P〉0.05）。艰难梭菌检测阳性患者住院期间均使用过头孢类、喹诺酮类、碳青霉烯类、广谱青霉素、克林霉素等其中一种或多种抗菌药物。结论该院艰难梭菌相关性腹泻比较严重,抗菌药物的使用是诱使艰难梭菌感染的重要因素。     

广泛耐药铜绿假单胞菌耐药基因和oprD2基因检测及同源性分析

目的探讨本院短期内分离的广泛耐药铜绿假单胞菌药物耐药基因和外膜蛋白基因opr D2携带情况,并分析其分子流行病学特征。方法收集本院2012年10月分离的对临床常用7类抗菌药物耐药或中介的非重复铜绿假单胞菌,采用K-B法检测药物敏感性,选出广泛耐药株和泛耐药株。采用PCR法检测β-内酰胺酶基因(OXA、CTX-M、TEM、PER、GES、DHA、IMP、VIM、NDM、SPM、CARB和KPC)、16S rRNA甲基化酶基因(arm A、rmt A、rmt B)、氨基糖苷类修饰酶基因(aac(6')-Ⅱ、aac(3)-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ)及opr D2基因,PCR扩增阳性产物进行DNA测序,用Blast进行序列比对分析。应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对泛耐药铜绿假单胞菌进行同源性分析。结果共筛选出23株广泛耐药铜绿假单胞菌,其中泛耐药菌10株。23株广泛耐药铜绿假单胞菌中,耐药基因检测阳性的有OXA-1群、OXA-10群、TEM、PER、CARB、VIM、arm A、rmt B、aac(6')-Ⅱ、aac(3)-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ,阳性率分别为21.7%、39.1%、47.8%、87.0%、26.1%、4.3%、8.7%、47.8%、60.9%、52.2%、47.8%。opr D2基因阳性8株,阴性15株,基因缺失率达65.2%(15/23)。阳性基因与Gen Bank中已知序列同源性均大于99%。10株泛耐药菌的PFGE图谱分为4个型,其中主流型A型有6株,B型2株,C型、D型各1株,且A型、B型均来自烧伤外科。结论我院2012年10月分离的广泛耐药铜绿假单胞菌携带多种耐药基因和外膜蛋白opr D2基因缺失是其耐药的主要原因之一,且存在多种耐药基因组合模式。同时我院发生了小规模的泛耐药铜绿假单胞菌克隆株的传播。     

甲胎蛋白和GGT-Ⅱ联合检测在肝癌患者诊断中的意义

目的：探讨两种肝癌标志物甲胎蛋白（α-fetoprotein,AFP）和γ-谷氨酰转移酶同工酶Ⅱ（γ-glutamyltransferase isoenzymeII,GGT-Ⅱ）单独检测和联合检测原发性肝癌（primaryhepatocellularcar cinoma,PHC）的早期诊断价值。方法：GGT-Ⅱ检测采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法,AFP检测采用电化学发光免疫分析法。分别对33例乙型肝炎患者,30例肝炎后肝硬化患者,44例原发性肝癌患者以及35名健康体检者进行GGT-Ⅱ和AFP检测,综合分析2项指标对PHC的诊断价值。结果：PHC组的GGT-Ⅱ和AFP的阳性率均明显高于肝硬化组、肝炎组和健康对照,差异有统计学意义（P〈O．01）,联合检测敏感性高于单一检测指标。结论：血清GGT-Ⅱ及AFP联合检测可提高PHC的诊断灵敏度,提高肝癌的早期检出率。     

肺炎克雷伯菌16S rRNA甲基化酶耐药基因研究

目的了解肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类抗生素的敏感性及16S rRNA甲基化酶检出情况。方法收集中南大学湘雅医院2009年1-7月非重复肺炎克雷伯菌96株,采用琼脂稀释法对庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素的最低抑菌浓度（MIC）进行检测;聚合酶链反应（PCR）扩增16S rRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA。结果肺炎克雷伯菌对阿米卡星、庆大霉素及妥布霉素的MIC50分别为256 μg/mL、512 μg/mL和512 μg/mL;MIC90均为＞512 μg/mL;耐药率分别为21.88%、63.54%、41.67%。68株（70.83%）菌至少对1种药物耐药,21株（21.88%）菌对3种药物均耐药。22株（22.92%）菌armA基因扩增阳性,未扩增到rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和npmA基因;22株armA阳性菌株中,17株（77.27%）对3种氨基糖苷类抗生素均耐药。armA阳性株与armA（FJ410928.1）基因序列同源性为100%。结论携带armA型16S rRNA甲基化酶基因是肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类药物高水平耐药的主要机制之一。     

自身免疫性肝病相关抗体检测及其临床意义分析

长期以来，有为数不少的肝病患者因病因不明或治疗效果不佳（包括少量病毒感染阳性患者）导致病情加重，给病人造成巨大痛苦。近年来国内外报道自身免疫性肝病的发病率有升高趋势，随着检测手段的提高发现这部分肝病患者中不乏此类疾病。自身免疫性肝病是一组病因不明的慢性肝脏疾病，分自身免疫性炎（AIH）、原发性胆汁性肝硬化（PBC）、原发性硬化性胆管炎（PSC）三大类。     

多重-PCR检测CTX-M超广谱β-内酰胺酶基因

目的建立一种多重PCR方法在肠杆菌中检测所有组的CTX-M基因。方法设计两组引物可分别在两个区域检测所有CTX-M组的大多数blaCTX-M基因。一条四组CTX-M基因的共同保守区引物与另外四条逆向引物或五条逆向引物一起同时使用可分别检测出每一组特异性CTX-M基因。PCR反应混合物体积25 ul含每条引物25 pM。对6株标准菌株(产CTX-M-26的肺炎克雷伯菌1株,分别产CTX-M-3,CTX-M-9及CTX-M-15的大肠杆菌各1株,产CTX-M-14的大肠杆菌2株)和90株临床分离株进行CTX-M检测。结果已知携带CTX-M的菌株作为标准均获得预期PCR产物,对90株临床分离株应用多重-PCR扩增,有68株获得阳性结果。进一步测序及分析显示,这些基因均为编码CTX-M-15超广谱β-内酰胺酶的基因。结论我们已成功设计一种多重PCR在单一反应管可同时检测多种CTX-M基因无须多次PCR反应。此方法可以快速准确检测出ESBLs表型阳性菌中CTX-M基因。     

卫生部全国细菌耐药监测网(Mohnarin)2007-2008年报告

目的 监测我国主要城市三级甲等医院住院患者的细菌耐药状况.方法 定点收集来自全国20家医院临床分离细菌,由中心实验室统一用平血二倍稀释法,测定抗菌药物MIC值.对2007年1月至2008年3月来自全国19座城市20家医院的5204株临床分离致病菌,进行了MIC测定.结果 革兰阳性菌1310株,占25.2%;革兰阴性菌3894株,占74.8%.MIC结果显示,对甲氧西林耐药葡萄球菌(MRSA)和对甲氧西林耐药表皮葡萄球菌(MRSE)检出率分别为73.6%和79.5%;未发现对万古霉素中介或耐药的葡萄球菌;凝固酶阴性葡萄球菌对替考拉宁有2.4%的中介率和1.2%的耐药率.粪肠球菌对青霉素的耐药率为23.7%;屎肠球菌则高达88.7%.在344株肠球菌中,发现2株对糖肽类耐药的VanA型屎肠球菌;5株对万古霉素中介的其他肠球菌.按口服青霉素V标准判断,对青霉素耐药肺炎链球菌(PRSP)和对青霉素中介肺炎链球菌(PISP)的检出率分别为17.3%和46.0%;非脑膜炎、非肠道系统给药的青霉素耐药率为0,中介率为0.8%.肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素,仍保持很高的敏感性,敏感率大于99%;此外,拉氧头孢、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦也具有很好抗菌活性,耐药率均在10%以下.非发酵革兰阴性菌中,铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌,对亚安培南的耐药率分别为29.3%和29.2%,较2004-2005年的监测结果有明显增加,但仍属于对非发酵菌抗菌活性较好的药物.此外,酶抑制剂复方制剂、氟喹诺酮类药物及米诺环素等也有较强抗菌作用.比较不同病房来源菌株耐药率显示,ICU菌株耐药率高于NICU,但两者之间的差距在缩小.结论 MRSA检出率以及金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和鲍曼不动杆菌耐药率增高,较以往的监测结果明显上升.大环内酯类、喹诺酮及氨基糖苷类药物抗菌作用明显低于欧美及日本等监测报道;大肠埃希菌对多种抗菌药物的耐药率,明显高于国外报道.