一种新的编码霍乱毒素的丝状噬菌体CTAKΦ

目的 探讨介导霍乱弧菌毒素基因水平转移的一种独特的遗传结构。方法 从O139群霍乱弧菌菌株FJ97129上清中分离出丝状噬菌体颗粒CTAKΦ，并进行电镜观察。从丝状噬菌体颗粒CTAKΦ中纯化出DNA，并进行链型分析。对pCTAK进行酶谱分析。用ctxAB、zot引物对pCTAK进行PCR扩增检测，用RS1探针对pCTAK进行Southern blot检测；用pCTAK转化DH5α和IEM101得到DX29和4329，将pCTAK克隆于pUC18载体并转入DH5α得到UD29，用GM1－ELISA检测DX29、4329、UD29的CT表达。对pCTAK的ctxAB、zot基因片段进行测序，并用DNASTAR软件和BLAST算法，在国际互联网上对测序结果进行序列分析。结果 发现和分离了一种编码霍乱毒素的质粒pCTAK，它以稳定的高拷贝数存在于1株天然的O139霍乱弧菌FJ97129中；酶谱分析发现其明显不同于CTX元件酶谱，在CTX元件中相当保守的酶切位点：BglⅡ、EcoRⅤ、PstⅠ、EcoRⅠ，在pCTAK中没有切点。ctxAB、zot引物对pCTAK的PCR扩增检测呈阳性，RS1探针杂交呈阳性；pCTAK的ctxAB、zot基因序列与已报道的序列有很高的同源性。pCTAK能直接或经载体转化DH5α和IEM101并表达CT。从FJ97129培养上清中分离出丝状噬菌体颗粒CTAKΦ，电镜观察并计算其直径大小为7nm左右。其全基因组大小为8.5kb，为单链DNA。结论 发现了一种新的编码霍乱毒素的丝状噬菌体CTAKΦ。     

霍乱弧菌溶原性噬菌体CTXΦ的氯霉素抗性基因标记及诱导

目的　对携带霍乱毒素基因的溶原性噬菌体CTXΦ进行遗传标记 ,以深入研究CTXΦ对霍乱弧菌的转染机制。方法　将CTXΦ基因组中ctxAB的上下游同源序列连接到cat基因的两侧 ,然后通过自杀质粒介导的DNA同源重组技术将霍乱菌株N16 96 1染色体上CTXΦ基因组中的ctxAB基因缺失掉 ,替换以氯霉素抗性基因 ,对CTXΦ基因组进行遗传标记 ,然后用丝裂霉素C诱导这种经抗性基因标记的噬菌体 ,再利用它对古典型霍乱弧菌的转染检测活性。结果　获得了ctxAB缺失、带有cat遗传标记的重组菌株N Φc;诱导出的CTXΦc噬菌体颗粒成功感染了霍乱菌株 1119。结论　N Φc中的CTXΦ带有了氯霉素抗性标记 ,诱导出具有感染活性的CTXΦc可用于研究毒力基因的水平转移     

霍乱弧菌的一种新的不含毒素基因CTXΦ基因组的复制功能研究

引起霍乱流行的霍乱弧菌菌株在遗传方面的一个重要特点是都带有霍乱毒素（CT）的基因ctxAB.对O139群菌株的分析中，发现一种新的不含ctxAB的CTXΦ基因组，其中的rstR基因和ig-2区与已发现的CTXΦ基因组的相应序列无明显同源性，     

霍乱弧菌O139菌株的分子生物学特征

为阐明Ｏ１３９霍乱弧菌的主要分子生物学特征，并为探讨其来源提供科学依据，应用核酸脉冲场凝胶电泳、基因探针Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交等方法，对国内外分离的２３株Ｏ１３９菌和一些Ｏ１群菌株进行分析。结果表明，所有Ｏ１３９菌株均表现为一致的且具有特征性的酶切图谱；它们与埃尔托型流行株的图谱较与古典型菌株图谱更为相似，与埃尔托非流行株和其他非Ｏ１菌株的遗传差异较大。在ＳｍａＩ图谱中，新疆分离的Ｏ１３９菌株显示出与当地１９８９年分离的埃尔托型流行株较接近的图谱；Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ结果显示在不同的酶切图谱分子杂交（ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＸｂａＩｃｔｘ，ＢｇｌＩ１６ｓｒＲＮＡ）中，Ｏ１３９菌株与Ｏ１流行株之间有一定的差异；我国分离的Ｏ１３９菌株具有一致的图谱，与印度和孟加拉国分离的Ｏ１３９菌株之间有较小差异；新疆分离的Ｏ１３９菌株与该地１９８９年分离的某些ＥＶＣ流行株的图谱相似。基因检测表明，Ｏ１３９菌株都具有ｃｔｘ、ｚｏｔ、ａｃｅ和ＲＳ１；ＭＥＥ分析表明，Ｏ１３９菌株的ＥＴ型与ＥＶＣ流行株不可区分。     

我国伤寒沙门氏菌的分子流行病学特征Ⅱ．部分伤寒沙门氏菌的16SrRNA基因多态性

利用ＰＣＲ扩增标记的Ｄｉｇ－ｄＵＴＰ－１６ＳｒＲＮＡ基因为探针，分析我国不同时间和地区分离的１１９株伤寒沙门氏菌和１株鼠伤寒沙门氏菌染色体经ＰｓｔⅠ消化后的１６ＳｒＲＮＡ基因限制性图谱。结果发现，各菌株的杂交片段范围为７．０～２６．５ｋｂ，每个菌株有５～１０条杂交带不等。通过对每个菌株的杂交结果进行数值分类，１１９株伤寒沙门氏菌可分为３８个ＲＴｓ，其中新疆伊犁１９９１年流行菌株和大连１９９０年爆发菌株大部分（１３／２０）为同一ＲＴ；从国内各高发省份分离的一些流行株也有相同的ＲＴ；而一些地区的散发菌株具有独特的ＲＴ；鼠伤寒沙门氏菌的ＲＴ则更为特别。对３９个ＲＴｓ，进行聚类分析发现：国内的一些流行菌株，爆发菌株在遗传距离０．５５处聚成一大类；而散发菌株，非流行菌株则在０．７０处聚成另一类。此外，从健康带菌者分离的菌株２５１所具有的ＲＴ单成一类。鼠伤寒沙门氏菌的距离更远。     

El Tor型霍乱弧菌口服活疫苗候选株IEM108的构建

目的 构建能够诱导抗菌抗毒素免疫和抵抗CTXΦ转染的霍乱弧菌生物安全性口服活疫苗候选株。方法 以不产毒的EI Tor型霍乱弧菌疫苗候选株IEMl01为出发菌株，以管家基因thyA为选择压力，在IEMl01的thyA基因缺失株IEMl01-T中，通过质粒．染色体致死平衡系统表达霍乱毒素B亚单位基因ctxB和介导CTXΦ噬菌体免疫的rstR基因。在家兔模型中，通过检测血清杀弧菌抗体和抗CTB的IgG抗体来评价该新建疫苗候选株的免疫原性；以对家兔攻毒试验后肠段积液量来评价其保护力。结果 含ctxB、rstR和大肠杆菌来源的thyA基因的重组质粒在：IEMl01-T中稳定存在，GMI-ELISA检测ctxB基因能够很好表达。动物试验表明，该新建疫苗候选株能刺激机体产生高滴度的血清杀弧菌抗体和抗CTB IgG抗体，能较好抵抗至少4μg纯品CT和不同毒株的攻击。结论 应用质粒．染色体致死平衡系统构建了能抵抗CTXΦ转染和稳定表达ctxB的生物安全性抗菌抗毒口服活疫苗候选株，其在家兔模型中有较好的免疫原性和保护力。     

O139霍乱弧菌CTAKΦ的基因水平转移的研究

目的 探讨CTAKΦ介导的霍乱弧菌毒素基因水平转移。方法 用抗生素敏感试验筛选出几组基因水平转移试验组合的供、受体菌，以便于用抗性筛选来确定基因转移的情况。在这几组试验组合中分别用接合转移、上清水平转移、培养液水平转移的方法，检查供体菌将CTAKΦ的A^RK^R抗性转移给受体菌的能力。结果 供体菌FJ97129、DX29能通过多种转移方式，以很高的频率将CTAKΦ的A^RK^R抗性转移给受体菌HK42、XJ93172、GD3188、7763、569B和94001；而受体菌IEM101对CTAKΦ有一定的抗感染能力。结论 CTAKΦ能够介导霍乱弧菌中霍乱毒素基因的水平转移。     

报告基因融合系统在研究细菌基因功能方面的应用

２．ｐｈｏＡ和ＴｎｐｈｏＡ系统［７，８，２７～３０］：碱性磷酸酶的氨基端部分序列对其表达酶活性非必需，当缺少氨基端（除信号肽以外）达１３个氨基酸时，碱性磷酸酶融合蛋白仍能显示同野生型相同的酶活性，但当３９或更多氨基端氨基酸缺失时，酶活性明显下降。比如...     

霍乱弧菌新类型溶源性噬菌体nct-CTX~(O139)ф基因组RS区及rstR-ig2基因的功能研究

霍乱弧菌CTXφ基因组RS区的间隔区ig2包括rstR启动子区和rstA操纵区,rstR基因编码产物RstR可以和rstA操纵区结合,抑制rstA基因表达,RS区负责噬菌体的复制、整合和解离等功能。我们克隆并测序了nct- CTX~(O139)φ基因组,RS区的rstR和ig2为首次发现的新类型,故进行上述功能研究。材料与方法一、菌株和质粒霍乱弧菌O1群EI Tor 7763株,不含CTXφ基因组任何基因,具有噬菌体基因组整合位点attRS；pNCT-RZ克隆子,含nct_CTX~(O139)φ基因组；大肠埃希菌HB101和JM109,自杀质粒pKTN701和受体菌SM10；上述菌株和质粒均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所保存。     

霍乱弧菌VPI毒力岛的tcpI-P和tcpH-A间隔区序列在不同菌株中的差异分析

目的：TcpA是霍乱弧菌主要定居因子毒素共调菌毛的主要亚单位，基因位于VPI毒力岛上。古典生物型和EI Tor生物型霍乱弧菌菌株的tcpA序列有较大差异，同时毒力岛上其他一些区域，主要包括部分基因的间隔区序列也存在差异。我们已在不同EI Tor流行株与非流行株以及非01／非O139菌株中又发现4种新的tcpA序列。笔拟探明这4种不同类型tcpA序列的菌株中，VPI毒力岛上其他几个差异片段(tcpI—P间隔区和tcpH—A间隔区)是否与相应tcpA序列有平行的变异关系、进而分析毒力岛和菌株分化的多样性。方法：在tcpI—P和tcpH—A间隔区外侧保守区中设计引物，扩增包含这两个间隔区的片段并进行测序，计算比较序列差异。结果：基因tcpH与tcpA之间的间隔区序列两两间比较的一致性在63．3％至95．3％之间；基因tcpI与tcpP之间的间隔区序列两两间比较的一致性在26．7％至100％之间。这些间隔区序列并没有像tcpA序列在这些菌株中的差异那样显示出类似的变异水平，甚至一些菌株的tcpA序列有较大差异时、某些区域反而高度一致。结论：在不同tcpA序列的菌株中tcpI—P间隔区和tcpH—A间隔区及tcpA这三个片段分化变异的速率不同，并不具有平行性。这些序列的多样性反映了霍乱弧菌VPI毒力岛以及菌株分化的多样性。这种分化也提示可能与这些区域具有结合一些调控因子、从而对环境信号产生不同方式或程度的应答的功能有关。