阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶eDNA克隆和序列分析

目的 近年研究表明Rab11鸟苷三磷酸酶在调节各种真核细胞的膜转运通道中发挥着重要作用。但是，对于原生动物毛滴虫膜转运系统的研究仍甚少。本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫Rabll鸟苷三磷酸酶基因，以便进一步探讨其功能。方法 使用SMART cDNA文库构建试剂盒构建阴道毛滴虫cDNA表达文库，用生物信息学进行TvRab11同源分析，鉴定TvRab11基因，用PCR方法扩增基因组DNA，TA克隆TvRab11 cDNA、测序及序列分析。结果 在分离出的cDNA克隆中发现一个Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因。该cDNA序列长710bp，读码框含636bp，推测蛋白质序列具211个氨基酸。序列分析表明该基因系Rab11亚家族的同源基因，其推测肽链与拟南芥Rab11c的同源性晟高（一致性60％，相似性79％），与人类Rab11b次之（一致性58％，相似性78％）。该氨基酸序列拥有Rab鸟苷三磷酸酶家族的所有保守结构域和特异性Rab结构域（RabF1-5）。进化树分析也表明该基因系Rab11的同源基因。序列分析还显示该基因的基因组DNA序列与cDNA序列完全一致．提示该基因无内含子。结论分析表明该基因是阴道毛滴虫Rab11鸟苷三磷酸酶同源基因，其功能有待进一步研究。     

珍香胶囊治疗子宫内膜异位症作用机制的初步研究

目的探索中药珍香胶囊治疗大鼠子宫内膜异位症的机制。方法采用自体子宫移植方法建立大鼠子宫内膜异位症模型。4周后，将大鼠随机分组进行药物治疗（珍香胶囊组、内美通组、空白对照组）。治疗4周后，免疫组化方法检测大鼠异位内膜组织的雌激素（ER）α和β受体、血管内皮生长因子（VEGF）、芳香化酶（Aromatase）。ELISA方法检测大鼠血清、腹腔液中白介素（IL）-6、VEGF、肿瘤坏死因子（TNF）α。结果疗效：珍香胶囊能够抑制、破坏异位内膜的增长，其作用与内美通相似。ER—α、ERβ、VEGF、IL-6、Afomatase在对照组及各用药组大鼠的移植组织中均有表达，各组之间无明显差异（P〉0．05）；ELISA检测各组大鼠血清、腹腔液中VEGF、IL-6、TNF—α水平，均未见阳性表达。结论珍香胶囊治疗大鼠子宫内膜异位症可能并不影响异位病灶组织的雌激素受体、血管内皮生长因子、芳香化酶，不影响大鼠血液、腹腔液的各种因子，其确切治疗机制目前尚不清楚。     

甲硝唑诱导阴道毛滴虫凋亡样细胞死亡

目的凋亡或程序性细胞死亡在多细胞生物体中已经被广泛研究,然而,关于单细胞寄生性原生动物细胞凋亡发生的分子机制却知之甚少。本研究旨在了解甲硝唑诱导阴道毛滴虫细胞凋亡的特征。方法培养阴道毛滴虫并用不同浓度的甲硝唑进行处理。在不同的时间间隔进行活细胞计数。提取甲硝唑处理过的阴道毛滴虫基因组进行DNA断裂片段检测。用DNA断端末端标记(TUNEL)法测定甲硝唑处理后阴道毛滴虫核酸内切酶活性。流式细胞检测分析脂酰丝氨酸暴露情况。结果甲硝唑可以诱导阴道毛滴虫出现凋亡样细胞死亡。这种凋亡样细胞死亡表现为细胞皱缩,磷脂酰丝氨酸暴露以及核染色体凝聚,但并未检测到寡核苷酸DNA梯带。结论阴道毛滴虫程序性细胞死亡的调节通路不同于多细胞生物体。确定导致原生动物细胞死亡的凋亡通路也许最终可用于鉴定新的治疗靶点。     

大鼠胰岛B细胞长寿基因SIRT1与转录调节因子FOXO1表达及其相关性研究

目的探讨大鼠胰岛B细胞在衰老进程中长寿基因SIRT1与转录调节因子FOXO1表达的相关性。方法2005年10月至2006年10月,在汕头大学医学院第二附属医院将11只18月龄健康雄性SD大鼠随机分为热量限制(CR)组6只和正常喂养对照组5只,饲养6个月后取胰尾组织,应用免疫组化染色分别检测胰岛中SIRT1、FOXO1和胰岛素表达及分布,衰老相关β-半乳糖苷酶(β-Gal)染色以反映胰岛B细胞衰老情况。结果SIRT1与FOXO1均可表达于胰岛细胞胞浆、胞核中;β-Gal和胰岛素表达于细胞浆中;与对照组大鼠相比,CR组大鼠胰岛SIRT1表达量较多(P<0.05),衰老相关β-Gal染色强度较弱(P<0.01),胰岛素表达量较低(P<0.05),但FOXO1表达量差异无显著性意义(P>0.05),伴随着SIRT1表达增加,FOXO1胞核阳性率明显降低(P<0.01)。结论热量限制诱导了大鼠胰岛B细胞SIRT1蛋白高表达;SIRT1可能通过抑制FOXO1活性而调控胰岛B细胞的衰老,有利于2型糖尿病的防治。     

阴道毛滴虫Rab6鸟苷三磷酸酶同源基因的cDNA克隆和序列分析

Rab鸟苷三磷酸酶是细胞膜转运机制的关键调节分子,与原虫的分泌功能密切相关。本研究旨在克隆和分析阴道毛滴虫Rab6鸟苷三磷酸酶同源基因,以便进一步探讨其功能。作者从阴道毛滴虫cDNA表达文库中分离出2个Rab6鸟苷三磷酸酶同源基因的cDNA克隆,其中1个cDNA序列长658对碱基,读码框含597对碱基,推测蛋白质序列具198个氨基酸。序列分析表明该氨基酸序列与Rab6a蛋白亚家族的同源性最高。另一cDNA序列长764对碱基,读码框含657对碱基,推测蛋白质序列具218个氨基酸。序列比对分析显示该氨基酸序列与Rab6b蛋白有较高的同源性。2个氨基酸序列都拥有Rab鸟苷三磷酸酶家族的所有保守结构域、特异性RabF结构域和典型的异戊烯化结构域。进化树分析提示毛滴虫的这2个基因系Rab6家族的同源基因,在进化上更接近原虫和单细胞的酵母Rab6亚家族。序列分析还显示这2个基因都无内含子,其基因组DNA序列与其cDNA序列完全一致。     

细粒棘球绦虫疫苗候选分子EgA31的GST融合蛋白原核表达及纯化

目的 :构建细粒棘球绦虫疫苗候选分子EgA31重组质粒 ,表达及纯化EgA31 GST融合蛋白 ,为疫苗的研究奠定基础。方法 :PCR扩增EgA31cDNA ,将得到的cDNA经限制性内切酶酶切 ,然后亚克隆入pGEX 5X 3质粒 ,转化BL2 1宿主菌 ,IPTG诱导重组质粒的表达 ,亲和层析纯化表达产物 ,Bradford法测定重组蛋白含量 ,用SDS PAGE和Westernblot进行分析鉴定。结果 :SDS PAGE显示分离纯化的EgA31 GST融合蛋白为 4 5kDa ,测序检验重组质粒中EgA31cDNA序列正确。EgA31 GST融合蛋白免疫豚鼠得到的抗血清可与细粒棘球绦虫原头蚴总蛋白在 6 6kDa处特异性反应。结论 :EgA31 GST融合蛋白获得高效表达 ,并成功纯化 ,初步实验证明具有良好的免疫原性 ,可用于进一步疫苗的免疫注射实验     

三种库蚊核糖体DNA第二内转录间隔区(ITS2)序列测定与系统进化分析

对广东省野外采集的库蚊属中2个亚属中的3种库蚊,褐尾库蚊Culex fuscanus(Lutzia、路蚊亚属)、二带喙库蚊Cx.bitaeniorhynchus和致倦库蚊Cx.pipiens quinquefasciatus(Culex、库蚊亚属)进行核糖体DNA第二内转录间隔区(ITS2)序列测定,并与GenBank中已知库蚊属中路蚊亚属、库蚊亚属、新库蚊亚属和黑蚊亚属的11种和伊蚊属1种蚊虫的ITS2进行序列分析。结果表明:褐尾库蚊与同亚属的非洲蚊种(Culex tigripes)亲缘关系最近,基因同源性为65.27%;库蚊亚属的二带喙库蚊与伪杂鳞库蚊基因同源性为75.87%;致倦库蚊与尖音库蚊复合组内淡色库蚊的基因同源性97.13%。在所选库蚊中,黑蚊亚属与伊蚊最接近,其次是新库蚊亚属和路蚊亚属的蚊虫。在库蚊属4个亚属中,路蚊亚属与库蚊亚属有更近的亲缘关系,这也印证了库蚊亚属某些幼虫与路蚊亚属幼虫具有相似习性的遗传基础。系统进化关系分析结果与经典分类学分类系统接近一致,但库蚊亚属的进化可能更具多样性。     

D-半乳糖致亚急性衰老大鼠的海马衰老信号的改变

目的:研究D-半乳糖(D-Galactose,D-gal)对大鼠海马细胞衰老相关信号的影响。方法:取6月龄雄性SD大鼠30只,平均分成两组,每组15只,D-gal组利用进行D-gal连续腹腔注射(120mg/kg.day),对照组注射同体积的PBS共10周。利用Western blot和免疫组织化学观察SirT1和FoxO3a的表达变化。结果:Western blot和免疫组化结果显示,SirT1在D-gal组表达明显降低(分别为p=0.02,p=0.018);FoxO3a的免疫组化检测发现,D-gal组的海马锥体细胞FoxO3a在胞核的分布明显高于对照组(p=0.002);而相对胞浆的分布却显著降低(p=0.005)。结论:短期给予D-gal能够导致大鼠海马衰老信号的改变。     

茶多酚对新生大鼠卵巢发育的影响

目的:探讨茶多酚对新生大鼠卵泡发育和卵母细胞凋亡的影响及相关调控机制。方法:受孕11.5dSD大鼠灌胃茶多酚(100mg/kg,qd)直至分娩,分别用多聚甲醛固定出生后1d、2d、4d、8d龄雌仔鼠卵巢(A组),同时将正常出生后1d的雌幼SD大鼠腹腔注射茶多酚(50mg/kg×1-8d),分别固定出生后2d、4d、8d龄卵巢(B组);所有卵巢经HE染色,观察不同发育阶段的卵泡比例,TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)荧光染色检测卵巢内卵母细胞凋亡变化,免疫组化方法观察叉头转录因子(FOXO3a)、促凋亡因子(Bim)和抗凋亡因子(MnSOD2)在卵巢组织中的表达水平,并以母、幼均未处理的正常同龄大鼠卵巢为对照(C组)。结果:在茶多酚干预组(包括A组和B组)卵巢内,1d、2d龄未装配卵泡比例及4d、8d龄原始卵泡比例均高于C组;A组、B组中卵母细胞TUNEL阳性率显著低于C组;FOXO3a、MnSOD2在A组的1d、2d、4d龄卵巢中的表达高于C组,但二组间的Bim表达水平相一致。结论:茶多酚能延缓新生大鼠卵母细胞巢破裂,抑制原始卵泡的发育启动,减少卵泡的消耗,可能有益于延长卵巢的生殖寿命;茶多酚可能通过上调FOXO3a的活性从而抑制原始卵泡的发育启动,同时通过激活其下游靶分子MnSOD2抑制卵母细胞的凋亡,促进卵母细胞的存活。     

限制饮食对老年早期大鼠生存状态和旷场行为的影响

目的 研究热量限制对老年早期大鼠的生存状态和行为学的影响.方法 选用18月龄的健康雄性SD大鼠,根据进食情况分为2组,一组为CR组(n=29)给予对照组进食量60%的食量饲养,对照组为ad libitum(AL)组(n=31)自由进食,观察6个月,在此期间,记录大鼠的生存状况,每周测定大鼠体质量;6个月后,进行旷场实验观察自发活动能力.结果 CR组给予60%的饮食控制后,体质量维持在低于对照组约20%左右(P<0.01).CR组的生存率为89.66%显著高于AL组67.74%(P=0.039);在旷场实验中测定的CR组大鼠自发活动路程为(201.06±78.35)m,显著长于AL组[(147.38±36.89)m,P=0.021],而CR组的自发活动速度为(78.10±34.38)mm/s也显著高于AL组[(48.96±14.87)mm/s,P=0.021],并且CR组大鼠具有在中央区域的活动距离长(P=0.048)和在周边区域活动速度快(P=0.012)的特点.结论 对老年早期的大鼠给予6个月的热量限制可以提高大鼠的生存率以及旷场活动能力,反映了大鼠的健康状况改善.