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81.
目的探讨工程菌表达的耐热DNA聚合酶的纯化方法。②方法收集IPTG诱导带有耐热DNA聚合酶(TD聚合酶)基因表达质粒的工程菌株DH-TD4,用溶菌酶裂解,60℃处理后,上清液用硫酸铵沉淀,根据溶解度差异进行粗分级,然后进行离子交换层析细分级,并经聚合酶链式反应(PCR扩增)鉴定其活性。③结果纯化的TD聚合酶具有良好的聚合活性。④结论溶解度差异与离子交换层析是工程菌表达的耐热DNA聚合酶纯化的主要步骤。基因工程制备的DNA聚合酶可用于PCR检测 相似文献
82.
83.
84.
85.
唾液酸化N-糖基化修饰重组蛋白能提高治疗性蛋白的理化性质,如延长半衰期、增强组织穿透性以及抑制炎症反应等。但迄今为止糖蛋白的N-糖基化修饰效率和唾液酸化效率都很难达到100%,这导致了唾液酸修饰糖基化重组蛋白的均质化、规模化生产非常困难。因而提高类人源化N-糖基化修饰治疗性重组蛋白的均质性仍是目前糖蛋白药物研发任务之一。该文围绕提高唾液酸糖表位N-糖基化修饰治疗性重组蛋白效率的方法及均质化类人源化唾液酸糖表位治疗性重组蛋白的生产途径展开综述。 相似文献
86.
人FascDNA的克隆及其在大肠杆菌中表达的研究 总被引:1,自引:1,他引:1
为获得高质量及充足的Fas蛋白,采用PCR技术调整Fas基因的开放阅读框架,使之与生物素化蛋白基因阅读框架一致;缺失了FascDNA基因的起始密码子并增加一个大肠杆菌偏性终止密码子,构建FascDNA和生物素化融合原核表达质粒PinPoint-Fas。将重组质粒转入大肠杆菌HB101,经500mmolIPTG在37℃条件下诱导4h,SDS-PAGE及Western印迹检测融合蛋白在大肠杆菌得以高效表达,表达量为细菌总蛋白的13.8%。用亲和层析树脂对生物素化融合蛋白进行亲和层析纯化,得到Fas重组的蛋白,且表达的Fas融合蛋白具有抗体结合活性。此蛋白的表达成功将解决Fas膜蛋白不易提取的难题,为深入研究Fas提供了良好材料来源 相似文献
87.
目的 通过基因工程途径获得胰高血糖素衍生物。
方法 根据胰高血糖素基因及凝血酶酶切位点序列,分段合成引物行 PCR 扩增,以 PCR 扩增得到的胰高血糖素-甘氨酸基因序列和 pET-30a 质粒转化 E.coli DH5α,获得重组质粒 pET-G。将重组质粒 pET-G 转化至 E.coli BL21(DE3),重组菌株命名为 E.coli BL21[pET-G]。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,对表达产物进行SDS-Tricine- PAGE[十二烷基硫酸钠-三(羟甲基)甲基甘氨酸-聚丙烯酰胺凝胶电泳]分析和蛋白质印迹分析。对表达产物行Ni2+-NTA亲和层析纯化、凝血酶酶切和高效液相色谱(HPLC)纯化后,行 SDS-Tricine-PAGE分析和飞行质谱分析,并以 ELISA 方法检测其免疫活性。
结果 PCR 扩增获得的条带与预期的DNA表达片段大小一致,重组质粒 pET-G 测序结果与预期完全一致。SDS- Tricine-PAGE 和蛋白质印迹分析显示 E.coli BL21(DE3)的表达产物相对分子质量与预期相符。经亲和层析纯化、凝血酶酶切和 HPLC 纯化后得到了完整的重组胰高血糖素-甘氨酸衍生物,SDS-Tricine-PAGE 分析显示其相对分子质量约为 3500,飞行质谱分析相对分子质量为 3531,二者基本一致。ELISA 检测表明重组胰高血糖素-甘氨酸衍生物具有胰高血糖素免疫活性。
结论 采用基因工程技术在大肠杆菌中成功表达了胰高血糖素-甘氨酸衍生物,为通过体外酰胺化途径研制酰胺化胰高血糖素奠定了基础。 相似文献
88.
重组人脑髓鞘碱性蛋白及其抗体的研究 总被引:1,自引:0,他引:1
将EcoR1和SalⅠ酶切的人脑髓鞘碱性蛋白(MBP)基因cDNA克隆片段与表达载体pGEX-5T重组后转化大肠杆菌,经筛选,增殖和IPTG诱导,阳性克隆SDS-PAGE结果证实表达一条特异42KDa区带,Western印记杂交证实该区带具MBP抗原特异性,免疫斑点杂交和ELISA检测表达产量占菌体可溶性蛋白含量6%,达到414.6mg/L菌液,将含可溶性MBP蛋白的菌液后SDS-PAGE分离纯化得重组MBP抗原,对新西兰兔进行背部皮下多点注射,5次免疫后以琼脂板免疫双扩法检测抗效价达1:16,并通过免疫斑点杂交和Western印亦杂交证实证抗体具抗MBP特异性。 相似文献
89.
目的 探讨3种大肠杆菌不耐热肠毒素突变体在辅佐幽门螺杆菌候选疫苗尿素酶B亚单位(rUreB)中的佐剂效应.方法 各组Balb/c小鼠分别用PBS、rUreB、rUreB LTK63、rUreB LTR72、rUreB LTKR及rUreB CT进行4次口服免疫.ELISA检测胃、肠、气管冲洗液sIgA以及血清IgG亚类(IgG1,IgGa);RT-PCR差异显示T淋巴细胞IFN-γ、IL-4 mRNA;ELISPOT检测肠派伊尔氏结IgA、IgG抗体分泌细胞.结果 ①各rUREB加突变体佐剂组在胃、肠、气管的sIgA和血清IgG1、IgG2a水平显著高于PBS组和单独rUreB组(P<0.01);②抗原刺激后取自各rUreB加突变体佐剂组T淋巴细胞表达的IFN-γ、IL-4 mRNA显著高于PBS组和rUreB组(P<0.01);③各rUreB加突变体佐剂组小肠派伊尔氏结抗体分泌细胞数都显著高于PBS组和单独rUreB组(P<0.01).结论 3种突变体都能辅佐rUreB在小鼠上产生特异的抗rUreB的抗体,且3种突变体诱导的免疫应答可能都是Th1/Th2型.LTR72的佐剂效应强于LTK63及LTKR.LTKR无毒,其稳定性高于LTR72,佐剂活性高于LTK63,是一个有希望的新型黏膜免疫佐剂. 相似文献
90.
中国版纳猪MHCI类P1分子全长的原核表达与纯化 总被引:8,自引:0,他引:8
目的:获得原核表达的中国版纳猪SLAI类P1蛋白质分子。方法:PCR扩增去信号肽的SLAI类P1cDNA序列,亚克隆至pGEMT载体,测序。将亚克隆的P1 cDNA片段插入表达载体pET42b(+),构建重组表达质粒pET-42b(+)/sla-pl,转化E·coli表达菌 BL21-CodonPlus(DE3)-RIL,IPTG诱导 P1-8 x his融合蛋白表达,经包涵体洗涤,8 mol/L尿素变性溶解,Ni2+亲和层析,梯度透析后,定量保存。SDS-PAGE、western-blotting鉴定目的蛋白的表达与纯化。结果:目的蛋白(分子量39.5 kD)表达量占细菌总蛋白 15%,每升表达菌获得纯度95%的目的蛋白 40 mg~60mg。结论:成功建立猪 SLA分子全长原核表达、纯化体系,为建立间接识别猪移植抗原SLAI类分子的人T细胞系及表位分析打下基础。 相似文献