微生物菌种选育中的基因组改组技术及其应用进展

该文论述了基因组改组技术的产生和原理、方法和特点,以及该技术的应用、意义及其发展前景.基因组改组技术是首先对微生物菌株进行诱变,筛选出正向突变的菌株,然后通过原生质体"递推式融合"使这些正向突变的若干个菌株进行基因组重组,从中筛选出符合育种要求的重组子,从而在短时间内获得性状得到大幅度提高的菌株.     

中温碱性脂肪酶的研究：V.扩展青霉PF868碱性脂肪酶在皮革及皮毛脱…

本文报导扩展青霉ＰＦ８６８产生的碱脂肪醇在动物皮革及皮毛脱脂工艺上的应用。试验结果表明：碱性脂肪酶２０￣３０ｕ／ｍＬ的浓度在ｐＨ９．０和温度３０￣３５℃条件下对猪皮、绵羊皮、兔皮及旱獭、狐狸和水貂皮毛具有良好的脱脂效果,脱脂率在８０％以上,高于传统碱法（Ｎａ２ＣＯ３）和表皮活性剂法（ＪＦＣ）。碱性脂肪酶不仅可脱尽皮板深层油脂,而且可以软化皮板。酶法脱脂的成革其抗张强度、伸长率、撕裂强度以及崩裂高度     

黑曲霉果胶裂解酶基因毕赤酵母在Pichia pastoris GS115中的表达

利用RT-PCR技术从黑曲霉(EIM-6)中扩增得到去除信号肽的果胶裂解酶基因A,将其插入到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,构建重组表达质粒pPIC9K-pelA,电击转化毕赤酵母GS115,得到了表达成功的工程菌株。用终浓度为1.5%的甲醇对其进行诱导,将发酵上清液浓缩后,用盐酸法测定其酶活可以达到2.3U/mL。通过对重组毕赤酵母诱导表达产物进行SDS-PAGE鉴定,发现重组毕赤酵母分泌了1个约38kD的蛋白,与该酶基因产物的理论值相符,并通过水解圈法测定验证,均说明果胶裂解酶得到正确的分泌表达.     

酿酒酵母adh2和ald6双基因缺失突变株的构建

酿酒酵母乙醇合成代谢过程中, 阻断或削弱乙醛至乙酸代谢流不但能增强乙醇合成流, 同时还能降低发酵乙酸含量。本研究以乙醇脱氢酶Ⅱ(adh2)基因缺陷型酿酒酵母YS2-Dadh2为出发菌株, 应用长侧翼同源两步PCR(LFH-PCR)策略构建乙醛脱氢酶Ⅵ(ald6)基因敲除组件, 转化酿酒酵母YS2-Dadh2敲除ald6基因, 之后转入表达质粒pSH65到阳性克隆中, 半乳糖诱导表达Cre重组酶切除Kanr基因筛选标记, 最后, 传代丢失质粒pSH65获得单倍体ald6基因缺失突变株。利用同样的敲除组件和技术再次敲除其等位基因, 最终获得双基因缺失突变株YS2-△adh2-Dald6。发酵实验表明与出发菌株YS2相比, 突变株乙酸合成量降低18%, 乙醇最高产量提高12.5%。     

酿酒酵母HOR2基因缺失突变株的构建

目的:构建酿酒酵母HOR2基因缺失的突变株并研究其对甘油和乙醇产量的影响。方法:以PCR为基础,通过同源重组的方式使目的基因缺失。结果:通过设计含有与HOR2(GPP2)基因两侧序列同源的长引物,以质粒PUG6为模板进行PCR构建含有Cre/loxP系统的酿酒酵母HOR2基因敲除组件,转化酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)YS2,获得为loxP-kan-loxP序列组件所替换而产生kanr的阳性克隆子。然后再将质粒PSH65转入阳性克隆子诱导表达Cre酶切除筛选标记,在原ORF基因处保留一个loxP位点,丢失质粒后获得HOR2单倍体缺陷型菌株。重复转化敲除组件实现另一条等位基因的敲除。发酵实验表明,突变株甘油产量降低3.34%,乙醇产量提高1.96%。结论:成功获得了酿酒酵母HOR2基因缺失的突变株,并命名为YS2-HOR2。     

基于空腔填充效应构建伯克霍尔德菌脂肪酶LipA的热稳定性突变体

【目的】中温伯克霍尔德菌胞外脂肪酶LipA在工业领域具有重要的应用价值。利用蛋白质工程技术来提高其热稳定性,对开发脂肪酶LipA酶制剂及提高其应用范围及应用效果,具有重要的意义。【方法】利用生物信息学软件Castp、Voronoia和Cave分析LipA分子中存在的空腔及其组成氨基酸残基;利用FoldX软件构建上述氨基酸残基的突变体电子文库,并基于空腔效应(体积变小)、自由能变化值(降低)和空间结构特点等对前述突变体电子文库进行筛选。从突变体电子文库中选择具有代表性的突变体,通过基因工程技术,引入突变。经诱导表达后,实验验证并筛选出热稳定性的突变体。【结果】构建了一个由58个突变体组成的电子文库;并对其中17个代表性的突变体进行了实验验证;筛选到2个热稳定性有明显提高的突变体LipA-His15Pro和LipA-Ala210Val;其叠加突变体LipA-His~(15)Pro/Ala~(210)Val的T50~(12)较野生型LipA提高了8°C,在55°C下的半衰期较野生型脂肪酶LipA提高了23.1倍。【结论】基于空腔填充技术构建热稳定性伯克霍尔德菌胞外脂肪酶LipA突变体,是一种行之有效的策略。     

γ-亚麻酸产生菌Mucor sp．EIM-10的筛选及分子鉴定

为了获得高产γ-亚麻酸（γ-linolenic acid,GLA）的菌株,利用苏丹黑染色法筛选获得1株GLA产生菌EIM-10,通过摇瓶培养,其生物量可达11．882g／L,菌丝体油脂含量可达18．86％。气相色谱-质谱（GC—MS）分析表明其γ-亚麻酸质量分数（占总脂肪酸）高达27．68％。为进一步鉴定该菌株,克隆测定了该菌18SrRNA基因序列,并对其进行系统进化树分析,结果表明该菌属于毛霉属,与Mucor racemosus、Mucor plumbeus、Mucor ramosissimus与Mucor circinelloides同属一个分支。     

lysC定点突变及lysC、asdA串联表达对谷氨酸棒杆菌L-苏氨酸积累的影响

lysC、asdA基因分别编码的天冬氨酸激酶(Aspartate kinase,AK)和天冬氨酸半醛脱氢酶(Aspartate semi-aldehyde dehydrogenase,ASD)是L-苏氨酸合成途径中两个关键限速酶基因,其中AK受到代谢产物赖氨酸与苏氨酸的协同抑制。以选育获得的一株谷氨酸棒状杆菌T11(Corynebacterium glutamicum T11)为出发菌株,通过构建lysC-asdA串联表达盒,并对其关键限速酶基因lysC进行定点突变,突变位点为Ala279Thr,获得抗反馈抑制突变型编码基因lysCr-asdA,将其插入含强启动子tac的穿梭表达载体pZ8-1中成功构建串联表达质粒pZ8-1-lysCr-asdA转化出发菌株,筛选获得工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA。摇瓶发酵其L-苏氨酸产量达到7.18 g/L,较出发菌株提高27.8%。进一步的30 L发酵罐补料分批发酵结果显示,发酵60 h L-苏氨酸产量达65.5 g/L,糖酸转化率达到39.5%,较出发菌株分别提高29.5%和33.9%,为后续的进一步构建高产L-苏氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株提供强有力的基础。     

基因改造Rhodobacter sphaeroides提高

[目的]通过敲除类球红细菌2.4.1基因组中八氢番茄素合成酶基因crtB,让异戊二烯前体更多流向辅酶Q10的合成.引入大肠杆菌编码的分支酸裂解酶基因ubiC和4-羟苯甲酸转移酶基因ubiA,提高4-羟苯甲酸的合成和与聚异戊二烯的连接,从而提高类球红细菌的辅酶Q10产量.[方法]以自杀型质粒pSUP202为载体,构建包含crtB基因上游2.5 kb片段,壮观霉素抗性基因,ubiC、ubiA基因和crtB基因下游2.5 kb片段的基因置换质粒,利用结合转移方法转入类球红细菌2.4.1中,利用抗性机制筛选双交换突变株,RT-PCR方法检测引入的ubiC和ubiA基因转录.用HPLC方法测定出发菌株和基因改造菌株的辅酶Q10产量.[结果]成功构建出基因置换质粒,筛选出发生基因置换的突变株,RT-PCR证实了外源基因的转录,并且突变株辅酶Q10的产量比出发菌株提高40％.[结论]大肠杆菌的ubiC和ubiA基因能够利用自身启动子在类球红细菌中表达,利用基因改造的方法能成功提高类球红细菌的辅酶Q10产量.