阿尔茨海默病中miR-29c对APP表达调控的初步研究

目的探讨microRNA29c（miR-29c）在阿尔茨海默病中的作用。方法采用了microarray芯片检测3月龄、6月龄APPswe/PSΔE9双转基因阿尔茨海默病小鼠大脑中microRNA表达情况并利用实时定量PCR验证结果可靠性,通过microRNA靶基因数据库预测选出与阿尔茨海默病相关的靶基因,构建miR-29c表达载体,将其转染SH-SY5Y及HEK-293T细胞,在高表达miR-29c的SH-SY5Y及HEK-293T细胞系中验证miR-29c对靶基因的调控作用。将靶基因APP mRNA的野生及突变3’UTR序列克隆到双荧光素酶报告基因载体,用双荧光素酶报告检测系统检测miR-29c与靶基因的结合位点。结果根据microRNA芯片结果筛选出在3、6月龄APPSWE/PS1ΔE9双转基因小鼠大脑表达均有差异的miR-29c,通过实时定量PCR证实miR-29c在3月、6月、9月龄小鼠中表达明显升高。通过microRNA靶基因数据库预测miR-29c可以调控阿尔茨海默病的靶基因APP,利用Western blot检测到高表达miR-29c的SH-SY5Y细胞及HEK-293T细胞中APP蛋白表达减少。将miR-29c表达载体与带有野生及突变APPmRNA的3’UTR的双荧光素酶报告载体共转染HEK-293T细胞,通过双荧光素酶检测系统检测未找到miR-29c与APP mRNA 3’UTR的结合位点。结论 miR-29c对APP表达的具有负向调控作用,但其调控位点可能不位于其3’UTR区域。     

APP695^K595N／M596L突变转基因小鼠的建立和病理表型动态分析

目的建立APP695^K595N／M596L（Swedish突变）转基因小鼠和评价痴呆表型的发生和发展过程。方法将APP695^K595N／M596L突变基因插入到小鼠朊蛋白（mouse prion protein）启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立APP695^K595N／M596L突变转基因C57BL／6J小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因表型,Western blotting检测APP突变基因表达。Thioflavin-S染色检测不同年龄转基因小鼠大脑病理改变。Morris水迷宫动态观察小鼠行为学改变。结果建立了人APP695^K595N／M596L转基因小鼠,Thioflavin-S染色显示转基因小鼠9月龄时在脑海马区可检测到老年斑形成,并且在11、12月龄时明显增多。Morris水迷宫结果发现与同月龄野生型小鼠相比,该转基因小鼠5月龄开始出现学习记忆能力缺陷,7、9、11月行为学结果证实转基因小鼠的学习记忆能力缺陷随年龄增加而日趋严重（P＜0．05）。结论建立了人APP695^K595N／M596L转基因小鼠,并能再现人类阿尔茨海默症的行为学及神经病理学特征,为阿尔茨海默病发病机制研究和药物研发提供了有价值的动物模型。     

长江三峡中坝遗址地层的孢粉学初步研究

对重庆忠县中坝遗址剖面82个地层样品和遗址附近的12个现代表土样品进行孢粉分析,结果表明:表土样品中孢粉含量较高,沉积地层中频繁出现蕨类植物孢子(相对于木本和草本花粉,其数量多,比例高),揭示出中坝地区植被长期处于次生化状态。表土花粉中,松在乔灌木中占明显优势;旱生草本花粉以蒿属、十字花科和菊科等为主;蕨类孢子以水龙骨、三缝孢子、凤尾蕨、石松孢子和单缝孢子为主,植被处于次生化。地层花粉中,蕨类孢子以凤尾蕨属、卷柏属、其它三缝孢子和单缝孢子为主;乔灌木植物花粉以松属和榆属占优势;草本植物花粉中,禾本科、菊科、藜科和蒿属等含量较高。研究点孢粉分析显示,人类活动对中坝遗址影响较大:1)新石器晚期:先人栽培种植活动已经开始;2)新石器时代末期至六朝,受人类活动影响,植被覆盖度较低;3)商代至周初至秦汉时期,人类活动不断加强;4)唐宋时期,人类栽培种植活动较活跃;5)明清至现代,人类砍伐当地植被日趋严重,导致植被次生化现象增强。     

KM突变小鼠慢性炎症性皮肤病的免疫学改变

目的 观察KM突变小鼠皮肤慢性炎症的病理变化,探讨该小鼠皮肤免疫学改变.方法 通过外部特征、常规HE病理组织学、免疫组织化学、特染方法对3月龄、6月龄KM突变小鼠皮肤炎症细胞及炎症因子进行检测并与KM野生小鼠皮肤炎症细胞及炎症因子浸润进行比较.结果 KM突变小鼠皮肤毛稀、皮屑、皮皱等;组织病理表皮细胞坏死,上皮角化过度或不全,颗粒层增厚,基底细胞层水肿,真皮浅层血管扩张,结缔组织炎细胞浸润等,皮肤CD3+、CD4+T细胞、巨噬细胞、肥大细胞等增多,同时炎症因子IL-6、IL-22、TNF-α、IFN-γ等增多;且这些炎症细胞及炎症因子浸润3月龄较6月龄增多.结论 KM自发突变小鼠皮肤组织出现自发的慢性炎症病变,与人类慢性炎症性皮肤病变有相类似的病理改变和细胞分子改变,有望培育成为一种新的慢性炎症性皮肤病的动物模型.     

柚皮苷及其与吴茱萸碱联合用药对APPswe/PS△E9转基因痴呆模型小鼠学习记忆能力的影响

目的 探讨柚皮苷及柚皮苷与吴茱萸碱联合用药对APPswe/PS△E9转基因痴呆模型小鼠学习记忆能力的影响,研究柚皮苷与吴茱萸碱联合使用是否具有协同或叠加作用.方法 APPswe/PS△E9转基因痴呆模型小鼠随机分组,每组12只,雌雄各半,分别选择在3月龄和5月龄两个时间段开始进行治疗,各给药组按设定剂量分别单独或联合加入鼠粮中.3月龄给药16周、5月龄给药4周后进行水迷宫实验,以安理申作为阳性药对照,并与安慰剂组小鼠进行比较.Thioflavin-S荧光染色检测单独使用柚皮苷治疗转基因小鼠脑组织老年斑的形成.结果 单独使用柚皮苷4周和16周,缩短寻找平台的潜伏期分别为22％、32％;单独使用吴茱萸碱4周和16周,缩短寻找平台的潜伏期分别为33％、10％.柚皮苷治疗16周减少海马老年斑26％.柚皮苷与吴茱萸碱联合应用能够显著缩短寻找平台的潜伏期47％.结论 单独使用柚皮苷或吴茱萸碱均能改善痴呆模型小鼠的学习记忆能力,柚皮苷长期的使用优于短期的治疗效果,但是吴茱萸碱短期有效,长期作用反而下降;柚皮苷与吴茱萸碱联合应用能够显著改善APPswe/PS△E9痴呆模型小鼠的学习记忆能力,但联合用药组并未表现出强于单独给药组的协同保护效应.     

甲型H1N1流感病毒感染不同免疫缺陷小鼠的比较

目的宿主免疫系统的功能状态在病毒的感染中起着至关重要的作用,本实验观察了不同免疫缺陷小鼠感染甲型H1N1流感病毒的差异。方法使用六个品系的近交系小鼠,经乙醚麻醉后进行滴鼻攻毒,分析其在病毒感染后存活率、体重变化和肺组织病理改变的异同。结果感染H1N1病毒的6种小鼠在观察的14d内,野生型的C57BL／6小鼠感染开始体重缓慢下降,感染后期有所回升,有半数存活;BALB／c小鼠和四种免疫缺陷品系小鼠感染病毒后体重随病情发展快速下降,死亡率均为100％。野生型C57BL／6小鼠感染初期为较弥漫的间质性肺炎,后期病变逐渐局限;BALB／c小鼠和四种免疫缺陷品系小鼠感染病毒后出现弥漫的中重度间质性肺炎,细支气管上皮有变性坏死,但炎症细胞明显少于C57BL／6小鼠。结论在甲型H1N1流感病毒的初次感染中固有免疫和特异性免疫分别在感染的初期和后期起主要作用,宿主免疫系统的功能状态影响着甲型H1N1病毒感染和预后。     

红色荧光和绿色荧光转基因小鼠模型的建立

目的建立红色荧光和绿色荧光转基因小鼠,为活体荧光影像系统建立重要的实验动物模型。方法把DsRed-Express和EGFP基因插入chicken-βactin强启动子下游构建转基因载体,建立红色荧光和绿色荧光转基因C57BL/6J小鼠。PCR鉴定红色荧光和绿色荧光转基因小鼠的基因表型,活体荧光影像系统分析红色荧光和绿色荧光转基因小鼠,荧光显微镜检测红色荧光和绿色荧光转基因小鼠全身组织器官的组织形态。结果分别建立了3个系的红色荧光和3个系的绿色荧光转基因小鼠。活体荧光影像系统分析转基因小鼠分别呈现红色荧光和绿色荧光。经荧光显微镜观察,DsRed-Express转基因小鼠的红色荧光蛋白在多个组织器官中表达,尤其在胰腺、肝脏、肾脏和脾脏等器官表达量较高。EGFP转基因小鼠绿色荧光蛋白在全身各个组织器官中表达,尤其在胰腺、心脏、小肠、外周血细胞和脑组织等器官组织中表达量较高。结论DsRed-Express和EGFP基因在转基因小鼠中系统性高表达,成功建立了红色荧光和绿色荧光转基因小鼠。DsRed-Express和EGFP转基因小鼠将成为活体荧光影像系统的重要实验动物模型。     

轴突生长抑制因子重组疫苗预防免疫减轻阿尔茨海默症模型小鼠行为学损伤

目的研究轴突生长抑制因子重组DNA疫苗对转基因阿尔茨海默症小鼠的预防治疗。方法轴突生长抑制因子重组DNA疫苗肌肉注射APP/PS1双转阿尔茨海默症模型小鼠。设野生对照组、模型对照组、空载体对照组、疫苗组。水迷宫实验检测小鼠行为学差别。结果疫苗组小鼠在4.5月龄水迷宫实验中学习记忆能力较模型对照及空载体对照组有显著差异（P〈0.05）。结论肌肉注射轴突生长抑制因子DNA重组疫苗能够改善小鼠学习记忆能力。     

双转基因小鼠模型中microRNA-153对RTN4的表达调控

目的探讨mir-153在阿尔茨海默病发病机制中的作用。方法通过microRNA芯片及Real-timePCR检测APPswe/PSΔE9双转基因小鼠脑内mir-153的表达;构建高表达mir-153的稳转细胞系,通过western-blot检测稳转细胞系内RTN4的蛋白表达;构建野生型及突变型RTN4的3’UTR荧光素酶报告载体,分别将其与mir-153表达载体或microRNA阴性对照载体共转染入293T细胞内,检测海肾荧光素酶的相对活性以验证mir-153对RTN4 mRNA的作用靶点。结果 microRNA芯片及Real-time PCR检测均证实3月龄APPswe/PSΔE9双转基因小鼠脑内mir-153的表达较同龄野生对照显著降低;在高表达mir-153的稳转细胞系内RTN4的蛋白水平明显降低;共转染野生型RTN4的3’UTR/mir-153表达载体可使海肾荧光素酶相对活性较共转染野生型RTN4的3’UTR/miRNA阴性对照质粒组显著降低（P〈0.05）,而共转染突变型RTN4的3’UTR/mir-153表达载体组则较之无明显差异。结论在3月龄APPswe/PSΔE9双转基因小鼠脑内存在mir-153的异常表达;mir-153可调控RTN4的蛋白表达;mir-153对RTN4的表达调控是通过结合RTN4 3’UTR 839-845碱基处的作用位点而实现的。     

老龄ICR小鼠对SARS-CoV的易感性

目的为探讨SARS的发病机制并提供易感的SARS动物模型。方法利用RT-PCR和病毒分离后免疫荧光技术检测成龄鼠和老龄鼠接种SARS-CoV后肺组织内病毒复制情况,同时观察两组动物的肺脏和肺外组织器官的病理变化,对肺组织进行免疫组化分析,观察SARS-CoV在肺内复制的主要部位。结果老龄鼠的感染率明显高于成龄鼠;老龄鼠肺脏出现更为严重的弥漫性肺泡损伤,其中两只老龄鼠的肺外器官出现了变性、灶状坏死以及血管广泛的扩张充血等全身中毒性变化;肺脏内病毒抗原主要存在于肺泡上皮细胞和间质的血管内皮细胞。结论老龄ICR小鼠对SARS-CoV的易感性明显高于成龄鼠,有可能作为研究SARS发病机制以及药物评价的动物模型。