产角鲨烯细胞工厂的构建及关键基因的筛选、克隆与表达

角鲨烯因具有很强的抗氧化、抗菌和抗肿瘤活性,被普遍应用于医药、保健品和化妆品等领域。文中在实验室构建的高效合成萜类化合物底盘菌株工作的基础上,以角鲨烯为目标产物,通过过表达法尼基焦磷酸合酶基因ispA得到高效合成三萜化合物的底盘菌株;然后对原核生物来源的角鲨烯合酶进行系统发育分析、筛选、克隆和表达,得到两株高效合成角鲨烯的大肠杆菌Escherichia coli工程菌株。其中,导入来源于嗜热蓝细菌Thermosynechococcus elongatus和深蓝聚球蓝细菌Synechococcus lividus的角鲨烯合酶的工程菌株,角鲨烯产量分别达到 (16.5±1.4) mg/g (细胞干重含量,后同) 和 (12.0±1.9) mg/g,发酵液浓度达到 (167.1±14.3) mg/L和(121.8±19.5) mg/L。相比于当前普遍使用的人源角鲨烯合酶及初代菌株,来源于T. elongatus和S. lividus的角鲨烯合酶分别使角鲨烯产量大幅提升了3.3倍和2.4倍,为原核细胞异源合成角鲨烯打下坚实的基础。     

两种UDP-葡萄糖脱氢酶对透明质酸生物转化的影响

分别从大肠杆菌和化脓链球菌中扩增出编码UDP-葡萄糖脱氢酶基因ecohas B和spyhas B,并将其插入T7表达载体p RX2构建重组质粒p RXEB和p RXSB。在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达,并对经镍柱纯化后的UDP-葡萄糖脱氢酶的酶学性质进行分析。酶学性质研究表明:spy Has B的最适反应温度是30℃,最适p H 10,最适条件下的比活力是12.2 U/mg;eco Has B的最适反应温度是30℃,最适p H 9,最适条件下的比活力是5.55 U/mg。从多杀巴氏杆菌扩增出的透明质酸合成酶基因pmuhas A分别与ecohas B和spyhas B构建共表达载体p BPAEB和p BPASB。将其转化到大肠杆菌BW25113中,经生物转化生产透明质酸(HA),并对转化条件进行了优化。结果表明:重组菌株进行透明质酸转化时,UDP-葡萄糖脱氢酶酶活力越高,稳定性越好,HA产量越高;转化条件优化后,p BPAEB/BW25113和p BPASB/BW25113在摇瓶中的产量分别是1.52和1.70 g/L,比之前报道的提高了2-3倍。     

基于筛选标记整合拷贝增加的酿酒酵母外源蛋白高效表达北大核心CSCD

【目的】利用酿酒酵母内部核糖体进入位点(IRES)介导构建外源蛋白高效表达系统,构建酿酒酵母蛋白表达工程菌,为酿酒酵母在代谢工程中的应用奠定基础。【方法】首先分别构建含启动子Pilv5,Padh2,Ptdh3的Promoter-mCherry-TIF4631 IRES-URA3共表达框,利用同源重组的方法将共表达框整合到酿酒酵母W303-1B-A基因组中,经URA3功能回复筛选转化子。然后比较转化子中mCherry荧光强度的差异,以表征三种启动子在共表达框中的应用效果。利用荧光定量PCR测定并分析转化子中整合DNA片段在基因组中的拷贝数,并在无选择压力的条件下连续传代培养转化子,分析其遗传稳定性。最后以木糖还原酶基因XYL1,β-半乳糖苷酶基因LACZ替换共表达框中的mCherry基因,检测木糖还原酶(xylose reductase)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)的酶活力、蛋白表达量等,以验证该表达框的应用效果。【结果】整合DNA片段的拷贝数和mCherry的表达量受启动子影响。其中含Padh2的转化子最低,含Ptdh3的转化子居中,含Pilv5的转化子最高。含有Pilv5启动子且mCherry表达量最高的转化子,整合DNA片段在基因组中的拷贝数为47,构建的工程菌株具有较好的遗传稳定性。在含Pilv5启动子和TIF4631 IRES的表达框中,木糖还原酶成功表达,其中活力最高的转化子WIX-10的酶活力为0.209 U/mg粗蛋白;β-半乳糖苷酶也成功表达,其中酶活力最高的转化子WIL-1的酶活力为12.58 U/mg粗蛋白。【结论】在酿酒酵母中,由Pilv5启动子和TIF4631IRES介导的外源蛋白表达系统能够高效表达外源蛋白,为外源蛋白在酿酒酵母中表达提供了新的策略,也为该系统在酿酒酵母代谢工程中的应用提供了充分的实验依据。     

不同生长性能苏姜猪保育猪肠道菌群差异分析

【背景】苏姜猪是优质瘦肉型新品种猪,断奶仔猪受到多方面应激影响会出现生长性能差异。【目的】研究不同生长性能的苏姜猪保育猪肠道菌群结构的异同。【方法】试验选取了同日龄、体重相近、健康情况良好的的保育仔猪100头,在相同的饲养条件下饲养42 d,试验结束选取体重较轻的为弱仔猪,3头弱仔猪体重为18.43±2.37 kg;体重较大的为健康仔猪,3头健康仔猪体重为27.37±1.36 kg。屠宰后,采集其空肠和盲肠内容物,提取微生物基因组DNA进行高通量测序分析其菌群结构。【结果】苏姜猪仔猪空肠和盲肠在菌群丰度、多样性上有极显著的差异(P<0.01)。苏姜猪仔猪空肠菌群优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)假单胞菌属(Pseudomonas)的非致病性菌株,占比超过90%。苏姜猪仔猪盲肠优势菌门依次为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)。门水平组成结构存在差异,弱仔猪厚壁菌门丰度低于健康仔猪、变形菌门丰度高于健康仔猪。苏姜猪盲肠中普雷沃氏菌属(Prevotella)、疣微菌科UCG-005 (Ruminococcaceae_UCG-005)、拟普雷沃菌属(Alloprevotella)等与纤维消化有关的菌属丰度较高。弱仔猪与健康仔猪盲肠菌群在属水平结构存在显著差异(P<0.05),弱仔猪盲肠中普雷沃氏菌-9 (Prevotella_9)、埃希菌-志贺菌属(Escherichia-shigella)、疣微菌科UCG-005 (Ruminococcaceae_UCG-005)、Norank_f_普雷沃氏菌(norank_f_ Prevotellaceae)高于健康仔猪,健康仔猪盲肠中乳酸杆菌属(Lactobacillus)、普雷沃氏菌-2 (Prevotella_2)、土孢杆菌属(Terrisporobacter)、狭义梭菌属1 (Clostridium_sensu_stricto_1)高于弱仔猪。其中乳酸杆菌属和土孢杆菌属与仔猪健康相关,埃希菌-志贺菌属与疾病相关。【结论】不同生长性能仔猪肠道菌群构成存在显著差异,研究结果为进一步研究苏姜猪肠道菌群的功能提供依据。     

全细胞催化生产N-乙酰神经氨酸的条件优化

【目的】N-乙酰神经氨酸有多种生物学功能,其在治疗流感、神经性疾病、炎症和肿瘤等方面具有重要的医药价值。N-乙酰神经氨酸现有的生产方法产量低、成本高,难以满足医药工业大规模的需求,因而急需建立一种经济高效的生产方法。【方法】在前期研究中,构建了一株产N-乙酰神经氨酸的代谢工程菌(Escherichia coliΔnanTEK/pNA),本研究通过单因素试验对工程菌生物转化生产N-乙酰神经氨酸的过程进行优化,包括工程菌细胞培养条件(培养温度和时间)和全细胞生物转化的各种条件(转化温度、时间、表面活性剂等)。【结果】经过条件优化后,建立了全细胞催化法生产N-乙酰神经氨酸的工艺流程,使N-乙酰神经氨酸的产量提高到294.39 mmol/L。【结论】该方法具有操作简便、高效和经济的优势,为N-乙酰神经氨酸的规模化生产奠定了基础。     

一株Sanguibacter sp.C4产几丁质酶基因的克隆与表达

Chi58是Sanguibacter sp．strain C4产生的一种胞外几丁质酶。通过chiA的特异性PCR引物探测到菌株C4中存在几丁质酶,并将扩增到的几丁质酶基因片段（chiA-F）克隆、测序后,提交GenBank数据库进行同源性搜索。对从GenBank中获得的高同源性序列进行比对,并根据保守区域设计2对PCR引物进行嵌套PCR,扩增出Chi58基因的开放阅读框（ORF）。测序结果表明该酶的ORF由1692个核苷酸组成,编码563个氨基酸,在N端有23个氨基酸的信号肽,其成熟蛋白的分子量应为58．544kDa。对其推导氨基酸的序列分析表明Chi58与沙雷氏菌的几丁质酶（如徂）有高度同源性（88．9％-99．6％）,其结构主要包括信号肽序列、PKD结构域和18家族糖苷水解酶结构域。将该基因克隆到pET32a（＋）载体构建重组质粒pChi58,转入大肠杆菌BL-21（DE3）进行融合表达。经IPTG诱导后,可见分子量约81．1kDa的融合蛋白的表达。     

合肥城区空气真菌浓度的时空分布特征

研究空气真菌群落结构和分布特征可为制定空气真菌污染防治对策和环境治理提供科学依据。我们于2005年7月至2006年6月,采用仪器采样法分别在居住区、交通干线、中心商业区、公园绿地4个功能区对合肥城区空气中的真菌进行了监测。结果表明,合肥城区空气已受到不同程度的真菌污染。城区空气中共分离得到真菌35个属,优势属为曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、毛霉属（Mucor）、根霉属（Rhizopus）、木霉属（Trichoderma）。空气真菌平均浓度为2,744CFU/m3,真菌浓度在居住区、中心商业区、公园绿地3个功能区由早、中、晚逐渐升高;在交通干线中午较高、早晚较低。空气真菌浓度的季节变化在居住区和交通干线不明显,而在中心商业区和公园绿地表现为春秋季较高,夏冬季较低。空气真菌浓度的全年变化在居住区和交通干线不明显,而在中心商业区的4月与10月、公园绿地的4月与9月,空气真菌浓度显著高于全年其他月份。空气真菌浓度分布的时空特征不仅与环境因素、大气污染等因素有关,还受到人类活动和植被等因素的影响。     

疏花水柏枝结构性状多样性研究

以疏花水柏枝(Myricaria laxiflora)茎的11个解剖结构参数作为表型性状,对覆盖整个分布区域的居群进行部分抽样取样,研究了该物种表型性状的多样性及其格局、表型性状的分化及其与环境的关系。结果表明,各性状在居群间以及不同居群总体性状之间都存在显著或极显著的差异,63％的表型分化属居群内分化,37％为居群间地理差异引起的分化,居群内性状的变异程度与立地环境条件的分化程度一致,奉节以上居群相似程度较大,而以下居群相似程度则较小,并有独立分化的居群出现,这表明表型性状的多样性中心是在三峡河谷区域内,而不是在三峡以上的河谷区段。     

疏花水柏枝种子结构特征的研究

对长江三峡库区特有河岸植物疏花水柏枝的种子适宜于水力传播的结构特征进行了研究,结果表明,成熟种子具直立型胚,无胚乳.种皮细胞一层,其外围有较厚的脂质层.胚轴和子叶的细胞均纵列排列,具较大列间隙,有时,在胚轴上可见位置不定的坑.胚根区有栅栏状细胞,珠孔区以上有薄壁细胞解体后形成的断裂层.中央维管网贯穿胚体,其盲端区常出现不能与之连通的局部输导组织.种子的结构特征为水力扩散提供了便利,但也限制了扩散效力.本文可为该物种的种群构建等生态学研究提供生物学根据.     

胎猪卵巢发生过程中的组织学变化

哺乳动物胎儿在出生前, 卵巢发生经历了众多连续的组织学变化, 主要包括原生殖细胞的增殖、分化, 原始卵巢和性索形成, 卵原细胞的增殖、分化和凋亡, 以及原始卵泡的形成、发育和闭锁等.卵巢发生是生殖活动中最初的也是重要的生理事件, 认识这一过程具有特殊的意义.此前, 关于猪胎儿期卵巢发育已经有零星的报道, 但对于卵巢发生过程中的组织学变化尚缺乏连贯和系统的描述.现结合已有的研究报道, 对猪卵巢发生过程中的组织学变化进行了全面的总结, 为相关研究工作提供一定的参考.