梨果黑斑病菌互隔交链孢(Alternaria alternata) hnr基因的克隆及其对侵染结构分化的调控

【背景】羟基萘还原酶(hydroxynaphthalene reductase,HNR)是1,8-间苯二酚(1,8-dihydroxynaphthalene,DHN)黑色素合成途径中起关键作用的酶,研究表明HNR不仅参与真菌黑色素合成,而且对其生长发育及致病性也具有一定的调控作用,但HNR对真菌病原物侵染结构分化的调控研究鲜见报道。【目的】在对梨果黑斑病菌互隔交链孢(Alternaria alternata) HNR的基因进行克隆与生物信息学分析的基础上,通过药理学方法初步探讨HNR对A.alternata生长及侵染结构分化的调控作用,为进一步揭示HNR在A.alternata侵染结构分化形成过程中的分子机制提供理论依据。【方法】对梨果黑斑病菌A.alternata的2个hnr基因进行了克隆;通过gene structure display server、open reading frame (ORF) Finder及conserved domain search等数据库及相关软件,对hnr基因及蛋白进行生物信息学分析,并利用HNR特异性抑制剂三环唑处理分析其对A.alternata生长发育、黑色素合成和侵染结构形成的影响,同时采用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)技术分析了hnr基因在A.alternata不同侵染结构分化时期的表达特性。【结果】从梨果黑斑病菌A.alternata克隆得到2个羟基萘还原酶基因hnr的编码区全长,分别命名为Aa4hnr和Aa3hnr,其中Aa4hnr基因全长为1 266 bp,编码了268个氨基酸,无内含子,有9个ORF;Aa3hnr基因全长为1 356 bp,编码了267个氨基酸,含有2个大小分别为51 bp和49 bp的内含子,有17个ORF;进化分析表明,Aa4hnr和Aa3hnr与Ophiobolus disseminans和Alternaria arborescens分别具有较高的一致性,同时Aa4hnr和Aa3hnr编码的蛋白均含有NAD (P)结合域,属于短链脱氢酶/还原酶(short-chain dehydrogenase/reductase,SDR)家族。药理学结果表明,三环唑处理显著降低了A.alternata DHN黑色素的生物合成,抑制了疏水性诱导的A.alternata侵染结构的形成;进一步分析Aa4hnr和Aa3hnr在疏水表面诱导的A.alternata孢子萌发阶段(2 h)、附着胞形成阶段(6 h)、侵染菌丝形成阶段(8 h)的基因表达量,Aa4hnr的基因表达量在A.alternata侵染结构分化的各个时期均发生下调,Aa3hnr在附着胞形成阶段(6 h)表达量下调,然而在侵染菌丝形成阶段(8 h)显著上调表达。【结论】Aa4hnr和Aa3hnr对梨果黑斑病菌侵染具有一定的调控作用。     

小叶章PPDK基因的克隆和生物信息学分析

[目的]获得小叶章PPDK的cDNA序列,推测蛋白氨基酸理化性质及二三级结构等,以及已知物种PPDK氨基酸系统进化分析。[方法]利用RT-PCR技术扩增PPDK序列,通过ProtParam、Blast、THMHMM、SOPMA等生物信息软件分析序列。[结果]获得了小叶章PPDK的c DNA序列,长1 035 bp,相对分子量41. 910 kDa,等电点为9. 70,氨基酸中含量最高的是丝氨酸,72个;蛋白二级结构中无规卷曲占48. 83%,不含信号肽和跨膜结构,氨基酸系统进化树结果分析发现小叶章PPDK与二穗短柄草、水稻亲缘关系最近。[结论]小叶章PPDK含有385个氨基酸,含1个PDRP活性调控位点,72个参与信号传导的磷酸化位点。     

结合肽P201与5-氟尿嘧啶联合用药对肝癌HepG2细胞的协同杀伤作用及抗耐药分子机制

目的:采用多种方法探究FoxM1/mdr1信号调控的结合肽P201与5-氟尿嘧啶(5FU)联合用药对肝癌细胞HepG2的协同杀伤作用及抗耐药分子机制。方法:CCK-8法测定联合用药对HepG2细胞的抑制杀伤作用;吖啶橙/溴化乙锭(AO-EB)荧光双染、AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡;细胞划痕和Transwell细胞迁移实验检测HepG2细胞迁移能力;最后通过qRT-PCR和Western印迹检测HepG2细胞中FoxM1、mdr1和ABCG2等耐药相关基因在mRNA水平和蛋白水平的表达量。结果:联合用药[P201(45.0μg/mL)+5FU(100.0μg/mL)]作用48h抑制率达83.8%,作用24h的抑制率为77.8%,显著高于单独用药(P<0.001);流式细胞术检测联合用药细胞凋亡率达43.4%,而单独用药分别为19.4%、25.1%;联合用药在mRNA水平可显著下调HepG2细胞中的FoxM1、mdr1耐药基因,与蛋白水平结果一致;联合用药可显著抑制HepG2细胞的迁移。结论:联合用药对HepG2细胞有强的抑制杀伤作用,在促进细胞凋亡的同时可显著抑制HepG2细胞迁移,且通过下调FoxM1、mdr1和ABCG2等耐药基因和蛋白的表达,增加HepG2细胞对5FU的敏感性。提示P201可提升肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,减少抗癌药物的副作用。     

拟环纹豹蛛附肢体毛感受器的扫描电镜观察

通过对拟环纹豹蛛(Pardosa pseudoannulata)附肢体毛(触毛、听毛、味觉感觉毛)的扫描电子显微镜观察,发现拟环纹豹蛛的触毛与体表形成的角度为锐角,触毛粗大,毛干较挺立,周围有绒毛环绕,触毛主要分布在蜘蛛体触肢的跗节、胫节和步足的跗节、胫节、端部处,其中第一步足分布最多,其数量较听毛和化学感觉毛多。拟环纹豹蛛的听毛细而长,基本垂直于表皮,毛囊深窝有褶皱,听毛主要分布于触肢和第四步足的胫节上,其余腿节分布较少,不同部位的听毛在形态、长度上没有太大的差别。拟环纹豹蛛的味觉感觉毛基部四周有微微隆起的圆形毛囊,味觉感觉毛大于听毛又小于触毛,四周被绒毛环绕,主要分布于蜘蛛的第一步足和第二步足的跗节胫节处,在触肢和螯肢也有少量分布。     

NDRG1对人肠癌细胞失巢凋亡的影响

目的:探讨NDRG1对体外培养的人肠癌细胞系失巣凋亡的影响。方法:采用慢病毒系统将NDRG1表达单元转入人肠癌细胞系SW620、HCT8中,建立相应的过表达稳定细胞系;通过siRNA的方法干扰HCT116和LOVO细胞系中NDRG1的表达,分别在非贴壁培养的情况下培养48小时,采用流式细胞术和TUNEL染色检测细胞的凋亡情况。结果:在贴壁培养条件下,NDRG1过表达并没有显著影响肠癌细胞的生长及增殖,而NDRG1特异性siRNA干扰HCT116细胞中NDRG1的表达后,其凋亡率无明显变化(P0.05)。在悬浮培养条件下,NDRG1过表达的肠癌细胞的失巢凋亡率显著低于正常对照组(P0.05),而用三种不同的siRNA干扰HCT116及LOVO细胞中NDRG1的表达后,其失巢凋亡率均显著高于正常对照组(P0.05)。结论:NDRG1在体外可抑制人肠癌细胞的失巢凋亡。     

松墨天牛成虫室内外种群肠道细菌的多样性及功能分析

【目的】为明确松墨天牛Monochamus alternatus成虫中、后肠细菌群落结构,探索肠道细菌的潜在功能。【方法】分别提取室外和室内饲养的松墨天牛成虫各15头(室内和室外各15个中肠、15个后肠)的肠道DNA,利用二代测序技术对松墨天牛成虫肠道细菌的16S rDNA V3–V4区序列进行测序,统计操作分类单元(OTUs)数量,分析物种组成、Alpha多样性和Beta多样性;采用PICRUSt软件预测肠道细菌的功能。【结果】共获得544180条高质量序列,在97%相似度下将其聚类为615个OTUs,总共注释到22个门、48个纲、112个目、172个科、285个属和408个种。室内种群的OTUs数量多于室外种群,室内外种群的OTUs种类存在差异性。同一种群的中、后肠之间差异不明显。变形菌门Proteobacteria为室内外松墨天牛肠道细菌的最优势门;肠杆菌属Enterobacter为室外种群肠道细菌和室内种群后肠细菌的最优势属,沙雷氏菌属Serratia为室内种群中肠的最优势属。Alpha多样性结果表明松墨天牛成虫室内种群肠道菌群的丰度显著高于室外种群;Beta多样性结果显示室外种群肠道菌群均一性和稳定性比室内种群好。室外和室内种群的中肠与后肠之间在菌群丰度和多样性上均无显著差异。功能预测结果表明,室内外松墨天牛成虫肠道菌群中代谢通路的丰度最高,其中以糖类代谢和氨基酸代谢为主,还有降解外源化学物质、萜类和聚酮类化合物及其他次生代谢物质的能力。不同种群、不同肠段之间的功能丰度均无显著差异。【结论】明确了取食不同食料的松墨天牛成虫中、后肠的细菌群落结构及差异,了解了肠道细菌的潜在作用,为进一步探究松墨天牛肠道共生菌的功能提供了理论基础。     

鸡原始生殖细胞转染条件优化

为获得鸡原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)的最佳转染效率,本研究比较不同质粒用量和不同细胞数在3种转染试剂(Lipofectamine 2000、3000和LTX&Plus Reagent)中PGCs的转染效率,利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated c...     

双硫仑治疗小鼠肥胖的安全性和有效性评价

摘要 目的：观察双硫仑治疗小鼠肥胖的安全性和有效性。方法：取6周龄C57BL/6J雄性小鼠10只,高脂饲料诱导肥胖后,随机分为双硫仑组（双硫仑玉米油溶液,300 mg/(kg?d）和对照组（等量玉米油）,每组5只小鼠。每日灌胃给药1次,连续2周,期间仍给与高脂饲料。监测小鼠食物消耗量和体重。给药结束后取小鼠血清、附睾白色脂肪垫、肩胛间区棕色脂肪和肝脏。白色、棕色脂肪和肝脏进行HE染色,观察细胞形态。电镜下观察棕色脂肪细胞内的脂滴和线粒体。Realtime-qPCR法检测棕色脂肪组织中Ucp1、Fabp4、Prdml6和Cidea的mRNA相对表达量,Western blot法检测Ucp1的蛋白表达量。检测血清中转氨酶ALT和AST含量。取8周龄C57BL/6J雄性小鼠10只,随机分为双硫仑组（双硫仑300 mg/(kg?d）和对照组（等量玉米油）,每日灌胃1次,连续2周。给药结束后进行棕色脂肪和肝脏HE染色并检测血清中ALT和AST含量。取8周龄C57BL/6J雄性小鼠10只,随机分为双硫仑组（双硫仑300 mg/(kg?d）和对照组（等量玉米油）,每日灌胃1次,连续4周,进行肝脏HE染色并检测血清中ALT和AST含量。取孕13.5天的C57BL/6J胚胎小鼠,进行成纤维细胞原代培养,分为双硫仑组（双硫仑5 mg/L）和对照组（等量DMSO）并诱导分化为棕色脂肪细胞。分化8天后进行油红O染色,观察脂滴形成情况,检测Ucp1、Fabp4、Prdml6和Cidea的mRNA相对表达量和Ucp1的蛋白表达量。结果：肥胖小鼠给药过程中,双硫仑组和对照组的进食量及体重变化并无明显差别（P＞0.05）。给药结束后,两组白色脂肪细胞大小无明显差别。双硫仑组小鼠棕色脂肪细胞直径和细胞内脂滴明显增大（P＜0.05）,脂滴数量、线粒体形态及数量无明显差别（P＞0.05）。双硫仑组小鼠棕色脂肪中Cidea和Prdm16的mRNA表达减少（P＜0.05）。正常体重小鼠双硫仑给药2周后棕色脂肪细胞脂滴也增大。细胞实验结果显示,双硫仑组脂滴形成明显减少,Ucp1、Cidea、Prdm16的mRNA表达明显减少（P<0.05）;Ucp1的蛋白表达明显减少（P<0.05）。肥胖与正常小鼠双硫仑给药2周后均出现明显的肝细胞水肿,血清中ALT和AST升高（P<0.05）,正常小鼠给药4周后仍有明显肝细胞水肿,ALT和AST升高（P<0.05）。结论：短期使用双硫仑对饮食诱导的肥胖小鼠无明显减肥作用;双硫仑在体内、外均可抑制小鼠棕色脂肪细胞的分化。短期使用双硫仑可引起肝损害。双硫仑用于减肥治疗的安全性及有效性尚不够理想。     

直播软件在兽医微生物学辅助教学中的应用

直播软件是近些年来被大家广泛关注及应用的网络社交软件,该软件目前发展迅速,是大家工作、学习及生活娱乐的常用软件之一。本文简述网络直播平台的优势及特点,并根据兽医微生物学目前在教学中存在的几点问题,结合构建网络直播平台。网络直播平台的教学模式在提高学生学习热情、提高学习成绩、促进师生情感交流及提高教学质量都有很大的帮助。     

siRNA沉默G6PD表达对人皮肤黑色素瘤细胞生长及凋亡的影响

研究表明,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)与肿瘤的发生、发展、临床表型及治疗和预后有关.为阐明G6PD与肿瘤的关系及其机理,针对人G6PD基因设计3条siRNA和一条无关序列,再据每一序列,合成两条互补并含siRNA正反义链的DNA,退火后与含GFP的载体pRNAT-u6.2/Lenti连接,转染人皮肤黑色素瘤A375细胞,Real-time PCR筛选有效的一条siRNA,经病毒颗粒包装和病毒生产并感染A375细胞,G418筛选后,挑取单个阳性克隆放大培养,Western blotting检测siRNA干扰G6PD效率为88.83%,构建成G6PD缺陷型A375稳转细胞(A375-G6PDA).与野生型A375细胞(A375-WT)比较,A375-G6PD△的G6PD活性仅为21.53%,细胞倍增时间延长,增殖被抑制,克隆形成率降低25%(P0.05),提示,G6PD缺陷可能通过下调P53蛋白表达和上调Caspase.3的表达,抑制G2/M期向G0/G1期转换的进程,促进A375的凋亡,机理有待于进一步探讨.