内蒙古高原针茅草原群落β多样性研究

用比较样地法调查了内蒙古高原 4类地带性针茅 (Stipa)草原群落的 β多样性特征 .结果表明 ,Whit tacker指数 βws与尺度有关 ,随取样面积的增加 ,βws逐渐降低 .取样面积相同时 ,4类群落的 βws比较接近 .各群落的Cody指数最初也随样方面积的扩大而增大 ,当样方面积扩大到一定尺度时 ,贝加尔针茅群落和大针茅群落为 >0 .5m2 ,克氏针茅群落和小针茅群落为 >2m2 ,Cody指数趋于稳定 .同一尺度下 ,贝加尔针茅群落的Cody指数最高 ,小针茅群落的Cody指数最低 .多数情况下 ,群落内样本间的间隔距离 ,对Cody指数有较大的影响 ;从贝加尔针茅群落到小针茅群落 ,植物生活型和生态类群功能群组成中 ,多年生丛生禾草与根茎禾草、多年生杂类草和中旱生植物的多样性显著降低 ,旱生植物多样性先增加 ,尔后到小针茅群落显著降低 .群落的植物种类组成表现出明显生态替代现象 ,不同群落间的Cody指数逐渐降低 ;贝加尔针茅群落与大针茅群落的Morisita Horn指数最高 ,达 0 .72 .克氏针茅群落与小针茅群落的相似系数最低 ,为 0 .42 .     

人源中和性抗狂犬病毒基因工程抗体的研制

从具有高滴度狂犬病毒抗体的多位疫苗注射者采集外周血淋巴细胞,构建人源抗狂犬病毒Fab基因工程抗体文库。用纯化的狂犬aG和CTN株病毒颗粒富集筛选所得Fab噬菌体抗体文库,利用ELISA和间接免疫荧光法IFA鉴定所得人源单克隆抗体Fab段基因的功能特性,并通过序列测定确定所得抗体的轻链和重链的型别,成功获得11株抗狂犬病毒糖蛋白的人源单克隆Fab抗体。将其中5株人源单克隆Fab抗体的轻链和重链分别克隆入全抗体表达载体pAC-L-Fc后转染昆虫Sf9细胞,利用杆状病毒系统实现全抗体的分泌型表达。5株全抗体在体外与狂犬病毒CVS-11株的中和反应中均显示具有狂犬病毒中和活性。人源中和性抗狂犬病毒基因工程全抗体的获得为我国自行生产抗狂犬病单克隆抗体鸡尾酒奠定了物质基础。     

Pichia pastoris酵母中表达人源中和性抗甲型肝炎病毒scFv-Fc融合抗体的研究

为了探讨人源抗甲型肝炎（甲肝）病毒scFv—Fc融合抗体在酵母中的表达特性,将获得的人源抗甲肝病毒中和性单链可变区抗体（scFv抗体）基因克隆入含信号肽及人IgG1Fc抗体基因的酵母细胞表达载体中,获得了一株中和性人源抗甲肝病毒pPiscFv—FcHA16融合抗体的分泌表达,并对表达产物进行了纯化。同时对表达产物的生物学特性进行了一系列鉴定。表达的pPiscFv—FcHA16融合抗体为具有不同糖基化形式的同源二聚体,与相应的CHO细胞表达的IgG抗体相比,pPiscFv—FcHA16融合抗体仍保持很好的抗原结合活性,以及与中和性鼠抗甲肝病毒单克隆抗体的竞争抑制能力。同时也保持了对甲肝病毒的体外中和活性。这些结果表明,在酵母中表达的单链可变区（scFv）与IgG1Fc区的融合抗体具有很好的生物学活性,有希望用做体外诊断,用纯化相应的抗原,或者可能用于体内预防与治疗。     

寨卡病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒三重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及评价

本研究旨在建立寨卡病毒(ZIKV virus,ZIKV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)以及基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)三种病毒快速筛查、诊断的核酸检测技术。选用ZIKV的NS1基因、DENV的NS5蛋白基因以及CHIKV的E1蛋白基因作为靶标区域设计三组特异性引物探针,建立三重实时荧光定量RT-PCR检测方法。用ZIKV、DENV、CHIKV病毒体外转录RNA和病毒细胞培养物对该方法的灵敏性、特异性、重复性等方面进行评价,最后临床样本以及模拟标本验证。结果显示:三重实时荧光定量RT-PCR检测方法扩增效率均可达到90%以上,三种病毒体外转录RNA最低检测限均低于15拷贝/PCR,病毒培养物最低检出限均低于10PFU/mL且与单重检测方法无明显差异。与其他病毒无交叉反应,变异系数均在2%以内。临床标本及模拟标本检出率均可达95%以上。本研究建立的检测寨卡病毒、登革病毒以及基孔肯雅病毒的三重实时荧光RT-PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于寨卡病毒病等相关临床标本的检测。     

发热伴血小板减少综合征病毒灭活病毒的纯化及免疫原性初步研究

为了解纯化后灭活发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome bunyavirus,SFTSV)的免疫原性,本研究通过超滤浓缩和分子筛层析相结合的方法对灭活的SFTSV进行纯化,采用Western blot和SDS-PAGE对灭活病毒的纯化样品进行分析和鉴定,采用双抗夹心ELISA方法对其中糖蛋白(Glycoprotein,GP)和核蛋白(Nucleoprotein,NP)的抗原含量进行检测。浓缩纯化的SFTSV灭活病毒,经电镜观察并通过BCA法测定其总蛋白浓度。然后,将纯化的灭活SFTSV按两种不同的免疫程序免疫新西兰兔,评价免疫原性和比较免疫效果。结果显示,SFTSV灭活并超滤浓缩后,分子筛层析可观察到两个洗脱峰,其中之一为灭活病毒颗粒,SDS-PAGE、Western blot和ELISA法分析均可检测到GP和NP抗原,而另一洗脱峰主要成分则为NP。浓缩后的纯化病毒纯度达90%以上,总蛋白浓度约为1.1mg/mL,且具有典型的布尼亚病毒电镜形态。纯化的SFTSV灭活病毒免疫实验动物后,可在血清中检出高滴度病毒特异性IgG和中和抗体,但抗体滴度受免疫程序的影响,0d、14d和28d天三针程序免疫动物的效果明显优于0d、7d和28d免疫程序组。本研究显示了灭活SFTSV培养液中除完整病毒颗粒外,还含有大量游离的NP,经分子筛层析纯化可获得高纯度灭活病毒,同时明确了纯化的SFTSV灭活病毒具有良好的免疫原性,可诱导产生高滴度中和抗体和病毒特异IgG抗体,可为灭活病毒疫苗的进一步研究提供重要的线索。     

中国仓鼠卵巢细胞中稳定表达发热伴血小板减少综合征病毒样颗粒新方法的研究

为了探索发热伴血小板减少综合征病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)样颗粒的高效表达方法,本研究根据布尼亚病毒装配成熟的机制,建立SFTS病毒包膜糖蛋白和核蛋白融合表达质粒,并在表达载体中引入荧光蛋白报告基因,转染中国仓鼠卵巢细胞,传代培养两代后,根据荧光蛋白表达水平,采用有限稀释法,在荧光显微镜下,人工挑选细胞集落,建立病毒样颗粒稳定表达细胞系,并通过荧光蛋白表达水平的变化,评价细胞系的稳定性,采用间接免疫荧光、免疫印迹和电子显微镜对病毒样颗粒进行分析鉴定。结果显示,融合表达的包膜糖蛋白和核蛋白可在细胞内装配形成病毒样颗粒并分泌到胞外,在无选择压力条件下筛选的细胞系能够在较长时间内保持稳定,传代40次后报告基因表达水平无明显变化。本研究显示了通过病毒结构蛋白基因的修饰,可以改进病毒样颗粒制备方法,为相关生物制品的生产技术研究提供了重要线索。     

在我国发现普马拉病毒新亚型

对我国东北地区捕获的157份棕背鼠平的肺组织进行普马拉病毒检测.其中免疫荧光检测出阳性标本1份,PCR检测出核苷酸阳性标本7份.对PCR产物进行测序后发现,其核苷酸的序列与报道的普马拉病毒核苷酸序列存在着差异.系统进化分析表明,我国发现的这株普马拉病毒,在进化树上形成了一个新的分支,为一新亚型.并且与在韩国和日本发现的普马拉病毒亲缘关系最为接近.     

用表达T7RNA聚合酶细胞系拯救麻疹病毒微复制子

构建稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系,用于提高拯救麻疹病毒微复制子效率.PCR扩增T7RNA聚合酶基因,克隆到真核表达载体,转染Vero细胞,用G418筛选到稳定表达的细胞株Vero/pcDNA3-T7.用Westernblotting证明了T7RNA聚合酶在细胞中的表达.将T7启动子控制绿色荧光蛋白表达的质粒转染该细胞后,绿色荧光蛋白在细胞株中得到表达.反向插入报告基因的微复制子转染感染麻疹病毒的Vero/pcDNA3-T7细胞后,细胞中能够检测到报告基因的表达.用细胞系取代痘苗病毒系统,可以提高拯救效率.     

用反向被动血凝及血凝抑制方法检测流行性出血热病毒抗原和抗体

本文建立了检测流行性出血热病毒(EHFV)液体抗原及抗体的反向被动血凝(RPHA)和血凝抑制(RPHI)方法,RPHA检测EHFV抗原的敏感性与ELISA相近;RPHI检测EHFV抗体与IFA的符合率为97.3％,敏感性略低。