人SCF基因转染NK细胞系的生物学特性研究

目的；研究SCF基因转染NK细胞系的生物学特性。方法：利用LipofecTAMINE将SCF真核表达载体pcDNA3-hSCF转染NK－92细胞系，RT－PCR鉴定表达SCF的细胞克隆并以SCF依赖细胞株TF－1激活，MTT法检测增殖和杀伤活性。流式细胞术检测细胞表面分子CD3，CE16和CD56。结果：建立表达hSCF基因的NK－92－hSCF细胞株，在IL－15培养条件下，其增殖能力显著高于NK－92，并且低剂量的IL－15可以维持其较高的杀伤活性流式细胞术检测细胞表面分子CD3，CD16和CD56。结论：可以通过SCF基因修饰NK－92，改变其生物学特性，提高其增殖能力，使NK细胞系有更实用的应用价值。     

人NKG2D的基因克隆及其在CHO细胞中的表达

目的:构建重组人NKG2D真核表达载体并在CHO细胞表达重组人NKG2D。方法:用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段,克隆到pGEM-TEasy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制内切酶EcoRI和BamHI消化pGEM-TEasy/NKG2D重组质粒,分离NKG2D片段,并插入真核表达质粒pEGFP-N1的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pEGFP-N1/NKG2D。然后经脂质体介导转染CHO细胞。应用荧光显微镜观测、Westernblot方法和免疫组化染色对转染细胞内pEGFP-N1/NKG2D的表达进行鉴定。结果:RT-PCR扩增获得650bp基因片段,经DNA序列分析证明所获得的DNA序列与文献报道的NKG2D序列一致。转染的CHO细胞在荧光显微镜下发出强绿色荧光,Westernblot分析显示重组蛋白能特异地与抗人NKG2D单克隆抗体结合;免疫组化检测显示,转染的CHO中有棕色颗粒,证明所构建的NKG2D真核表达载体可以在细胞中表达。结论:构建了人NKG2D的哺乳动物细胞表达载体,并成功地在CHO细胞中获得重组人NKG2D的表达。     

转染IL-16基因对T淋巴瘤细胞的增殖抑制作用

目的 构建IL-16真核表达载体,研究其对T淋巴瘤细胞的增殖抑制作用。方法 应用RT-PCR技术从人外周血单个核细胞中获取IL-16cDNA,构建并鉴定真核表达载体PcDNA3-IL-16转染Karpas T淋巴瘤细胞,采用MTT法和流式细胞术分析IL-16对Karpas T淋巴瘤细胞的增殖抑制。结果 PT-PCR显示转染PcDNA3-IL-16的Karpas T淋巴瘤细胞高表达IL-16mRNA,MTT法检测显示其对Karpas T淋巴瘤细胞具有抑制作用,流式细胞术检测转染PcDNA3-IL-16的Karpas T淋巴瘤细胞高表达CD95分子。结论 成功构建了真核表达载体PcDNA3-IL-16,转染Karpas T淋巴瘤细胞能使其生长受到明显抑制,并且CD95分子表达增高,可能与诱导细胞凋亡有关,说明向肿瘤细胞转染IL-16是一种有用的肿瘤生物治疗方法。     

应用巢式RT-PCR结合RFLP、SSCP对山东肾综合征出血热病人血清中HV基因检测和分型研究

目的探讨山东肾综合征出血热重疫区病人血清中HV分子生物学特征,同时寻找准确、简便、迅速的HV检测与分型方法,从而为制定防治决策提供科学根据。方法从山东肾综合征出血热重疫区临沂市费县收集病人早期血清,应用巢式RT-PCR对病人血清中的HV进行基因扩增,采用RFLP、SSCP分型,并进行序列测定与分析。结果48份临床和ELISA检测确诊的HFRS病人血清经巢式RT-PCR扩增后,41份阳性,阳性率85.42%。41份阳性标本巢式RT-PCR产物经HindIII、HinfI酶切后,呈现2种不同的RFLP图谱:33份显示与R22株相似的酶切图谱,应属SEOV型;另外8份显示出与HTN76-118株相似的图谱,属HTNV型,这8份HTNV型标本均为10-12月间收集的病人血清。41份阳性标本巢式RT-PCR产物经SSCP分析,亦呈现2种不同的图谱:33份具有与R22株相似的SSCP图谱,应属SEOV型;而另8份则与HTN76-118株具有相似的SSCP图谱,属HTNV型。对部分扩增产物序列采用系统进化树分析也得出类似的结果:sdp1、sdp2、sdp3与HTN型76-118株亲缘关系相近,属同一簇,而sdp22、sdp37与SEOV型Z37、R22株亲缘关系相近,属另外一簇,这与RFLP和SSCP获得的结果相一致。结论山东肾综合征出血热重疫区病人基因型以SEOV型为主,但在秋冬季节也存在HTNV型。巢式RT-PCR结合RFLP、SSCP法可对HV准确分型,而且简便、迅速,适合于大规模流行病学调查。     

苏木精染色法测定化疗药物对贴壁肿瘤细胞毒性作用的实验研究

目的:建立苏木精染色法检测贴壁细胞增殖活性和化疗药物对贴壁细胞毒性作用的方法.方法:用苏木精染色法测定贴壁肿瘤细胞的增殖活性;同时利用该方法测定长春新碱、5-氟尿嘧啶对M21和SGC7901细胞的毒性作用,以及顺铂对兔VX2细胞的毒性作用;并与MTT比色法进行对比.结果:苏木精染色法测定贴壁肿瘤细胞增殖活性结果与MTT比色法测定结果具有一致性,P>0.01.苏木精染色法测定各化疗药敏结果呈剂量依赖关系,3种肿瘤细胞系5次测定抑瘤率重复性良好(CV<8%),两种方法检测结果一致,P>0.01.结论:苏木精染色法用于贴壁细胞的增殖活性和化疗药物的细胞毒性测定,具有特异、稳定、经济和简便等优点.     

谷胱苷肽S转移酶M1和T1基因多态性与喉及下咽癌易感性的关系

目的：研究谷胱苷肽S转移酶M1（GSTM1）、谷胱苷肽S转移酶T1（GSTT1）基因多态性与喉及下咽癌易感性的关系。方法：采用多重PCR技术,对76例喉、下咽癌患者（患者组）和与之匹配的76例对照组进行GSTM1、GSTT1基因型检测。结果：患者组与对照组GSTM1基因缺失频率分别为59.2%和42.1%,差异有统计学意义（P〈0.01）,GSTM1基因缺失与喉、下咽癌易感性有关（OR=1.935,95%CI=1.069～3.510）;GSTT1基因缺失频率分别为57.9%和51.3%,差异无统计学意义。联合分析未发现两种基因在喉、下咽癌发生中具有协同作用。GSTM1基因缺失同时暴露于吸烟者患喉、下咽癌的风险性显著增加（OR=5.545,95%CI=2.158～13.528）。结论：GSTM1基因缺失可能增加个体患喉、下咽癌的易感性,且与吸烟在喉、下咽癌的发生中具有协同作用。GSTT1基因型可能与本市区喉、下咽癌发生无关。     

脑心通对实验性动脉硬化兔血管MCP-1基因影响的研究

目的探讨脑心通对动脉粥样硬化(AS)的防治作用及其可能机制。方法通过高脂饮食建立兔AS模型，采用反转录一聚合酶链反应(RT—PCR)检测腹主动脉单核细胞趋化因子(MCP-1)mRNA的表达。结果脑心通可降低主动脉MCP-1mRNA的表达，降低MCP-1的表达水平，减少泡沫细胞的形成。结论脑心通对AS的发生发展可起预防和治疗作用。     

结核分支杆菌Ag85B融合蛋白表达载体的构建及纯化

目的：构建结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌的融合表达载体,制备MBP／Ag85B融合蛋白并将其纯化。方法：常规方法构建重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B,内切酶EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定;重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B转化大肠杆菌,经0．3mmol／L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D thiogalactoside,IPTG）诱导表达产生融合蛋白（MBP／Ag85B）,Western blot鉴定表达产物。pMAL纯化树脂（Amylose resin）对MBP／Ag85B融合蛋白纯化。结果：重组质粒pMAL-p2-Ag85B经EcoRⅠ／HindⅢ酶切后,1％琼脂糖凝胶电泳证实Ag85B正向插入pMAL-p2载体,重组菌经IPTG诱导后,有约70kD蛋白表达,与预期的融合蛋白分子量相符,蛋白表达量约占细菌总蛋白量的40％;Western blot显示,MBP／Ag85B融合蛋白与人抗结核IgG抗体呈特异性反应;经Amylose resin纯化后,MBP／Ag85B融合蛋白的纯度可达95％以上。结论：成功构建结核分支杆菌Ag85B重组融合蛋白表达质粒并制备及纯化其融合蛋白,为进一步研究Ag85B生物学功能及其抗原表位分析奠定了物质基础。     

MHCI类样分子(MICA)在部分肿瘤组织和肿瘤细胞系中的表达及临床意义

目的:探讨MHC Ⅰ类样分子(MICA)在肿瘤组织和肿瘤细胞系中的表达及其临床意义.方法:分别采用半定量RT-PCR和免疫组织化学技术检测肿瘤组织和肿瘤细胞系MICA表达,MTT法测定NK细胞细胞毒活性.结果:人红白血病细胞K562、喉癌细胞系Hep2、宫颈癌细胞系Hela、肝癌细胞系HepG2和结直肠癌细胞系HT29均有MICA mRNA和蛋白表达,而人Burkitt淋巴瘤Raji和高转移肺癌PG不表达MICA.MICA表达阳性的肿瘤细胞对NK杀伤敏感性明显高于MICA阴性者.多数肿瘤组织存在MICA mRNA和蛋白表达,但并非在所有肿瘤均有表达,癌旁组织均无MICA表达.结论:肿瘤细胞表达MICA可激发NK细胞对肿瘤的杀伤,NKG2D及其配体的相互作用在肿瘤免疫监视中起着非常重要的作用,肿瘤细胞分泌sMICA分子为肿瘤发生免疫逃逸的机制之一.     

NKG2D真核表达载体的构建及其对YT细胞生物学功能的影响

目的：建立NK细胞受体NKG2D真核表达载体，通过转染NK细胞系YT，初步探讨NKG2D分子对YT细胞系杀伤功能的增强作用。方法：用RT-PCR方法从NK-92细胞中调取NKG2D基因片段，克隆到pGEM-TEasy载体并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ消化pGEM-T Easy／NKG2D重组质粒，分离NKG2D片段，并插入真核表达质粒pEGFP-N1的相应限制酶位点，酶谱分析鉴定重组表达载体pEGFP-N1／NKG2D。然后经脂质体介导转染CHO细胞和YT细胞。应用荧光显微镜观测、Western blot方法和免疫组化染色对转染细胞内pEGFP-NilNKG2D的表达进行鉴定，MTF方法观察YT细胞对肿瘤细胞的杀伤功能。结果：RT-PCR扩增获得650bp基因片段，经DNA序列分析证明所获得的DNA序列与文献报道的NKG2D序列一致。转染的CHO细胞在荧光显微镜下发出强绿色荧光，Western blot分析显示重组蛋白能特异地与抗人NKG2D单克隆抗体结合；免疫组化检测显示，转染的CHO中有棕色颗粒，证明所构建的NKG2D真核表达载体可以在细胞中表达；转染NKG2D真核表达载体的YT细胞对乳腺癌细胞具有更强的杀伤效果。结论：所获得的表达NKG2D分子的真核表达载体，通过转染YT细胞，初步鉴定所表达NKG2D分子具有生物学功能，可以提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。