Peroxiredoxin Ⅱ酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活效应检测

目的:应用酵母双杂交体系,构建人peroxiredoxinⅡ(PrxⅡ)蛋白酵母双杂交诱饵载体,并检测该载体的表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。方法:用PCR扩增PrxⅡ基因cDNA中编码完整开放阅读框的基因片段;将该基因片段与pGBKT7载体定向重组;用酶切和测序鉴定重组质粒;用醋酸锂法(Li-Ac)将序列正确的重组质粒pGBKT7-PrxⅡ转化入AH109酵母菌株,在缺陷性培养基上观察pGBKT7-PrxⅡ在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和单倍体及二倍体自激活功能。结果:成功构建pGBKT7-PrxⅡ重组质粒。转化有重组质粒和pGBKT7空载体的酵母菌都能在SD/-Trp/X--αgal平板上长出粉红色菌落,在SD/-His/-Trp/X--αgal,SD/-Ade/-Trp/X--αgal平板上不能生长,两种酵母菌在SD/-Trp液体培养基中培养16 h后,菌液的OD600均值均为0.9,说明AH109[pGBKT7-PrxⅡ]转化成功,对酵母菌株AH109无毒性且不具自主激活报告基因的功能。结论:成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7-PrxⅡ,该载体可作为酵母双杂交系统中的“诱饵”,该诱饵载体可应用于酵母双杂交系统3筛选PrxⅡ相互作用蛋白。     

Ku70在卵巢癌组织中的表达及其意义

目的：探讨Ku70在卵巢组织中的表达水平与卵巢癌发生发展的关系。方法：应用免疫组化方法检测Ku70蛋白在15例正常卵巢、20例卵巢囊腺瘤和71例卵巢癌组织中的表达。结果：Ku70在正常卵巢、卵巢囊腺瘤和卵巢癌组织中都有不同程度的表达，但卵巢癌组织中Ku70的表达明显高于正常卵巢组织和卵巢囊腺瘤，且卵巢癌组织分化程度越差则Ku70的阳性率越高，表达强度亦越强，不同组织类型的卵巢癌Ku70的表达无差异。结论：Ku70蛋白可能在卵巢癌的发生发展过程中起重要作用。     

STAT-3与Enolase-1在乳腺癌组织中的表达及意义

目的 探讨乳腺癌组织中信号转导及转录活化因子3(STAT-3)和糖酵解酶烯醇化酶(Enolase-1)的表达与雌孕激素受体、淋巴结转移、临床分期、病理分级等的关系.方法 免疫组织化学SP法检测126例乳腺癌和26例乳腺良性病变组织中STAT-3与Enolase-1的表达情况,并分析他们与临床病理参数之间的关系.结果 乳腺癌组织中STAT-3和Enolase-1的阳性表达率分别为82.5％和77.8％,明显高于乳腺良性病变组织(11.5％和7.7％),差异均有统计学意义(x2=42.416,P＜0.05;x2=57.211,P＜0.05);在有淋巴结转移的乳腺癌组织中阳性表达率分别为85.7％和90.5％,高于无淋巴结转移组,差异均有统计学意义(x2=9.184,P＜0.05;x2=11.014,P＜0.05).相关分析表明STAT-3和Enolase-1的表达呈正相关.在雌激素受体阳性(ER+)和/或孕激素受体阳性(PR+)或表皮生长因子受体2阳性(HER 2+)乳腺癌组织中,有淋巴结转移组中STAT-3和Enolase-1的表达水平均明显高于无淋巴结转移组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 STAT-3与Enolase-1的表达与乳腺癌的发生发展及侵袭转移相关,且二者有协同作用(r=0.379,P＜0.05).在ER+和(或)PR+或HER-2+乳腺癌组织中,STAT-3和Enolase-1的高表达与淋巴结转移相关.在高表达STAT-3的乳腺癌组织中Enolase-1表达也较高,其联合检测可作为判断乳腺癌恶性程度、评价预后及指导治疗的一项评估指标.     

小鼠腔前卵泡不同分离方法的比较

目的 探讨小鼠腔前卵泡的最佳分离方法.方法 取性未成熟小鼠的卵巢,按照不同分离方法,单纯机械法与酶解法分离腔前卵泡,并用基础培养基进行培养,比较不同分离方法获得的卵泡数量、形态,及对其早期生长发育的影响.结果 2 mg/mL的胶原酶可获得大量基底膜完整的腔前卵泡及裸卵(P<0.01);体外培养2d后,酶解组卵泡生长直径大(P<0.05)、GVBD率、放出第一极体率和7d生存率无明显差异(P>0.05).结论 胶原酶酶解法较单纯机械法更易获得大量高质量腔前卵泡,且对其早期发育无明显影响.     

紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡及对survivin基因表达的影响

目的 :观察紫杉醇对人卵巢癌细胞系A2 780凋亡的作用 ,探讨其对卵巢癌细胞survivin基因表达的影响。方法 :应用MTT、流式细胞仪等方法研究紫杉醇对卵巢癌细胞系A2 780凋亡的诱导作用 ,运用RT- PCR分析紫杉醇对卵巢癌细胞survivin表达的影响。结果 :紫杉醇可诱导卵巢癌细胞系A2 780凋亡 ,不同浓度的紫杉醇引起的凋亡率不同 ,在紫杉醇浓度≥ 10 - 7mol.L- 1时 ,凋亡率显著升高。经紫杉醇作用后的卵巢癌细胞表达sur vivin较用药前明显下降。结论 :紫杉醇可能通过抑制survivin的表达 ,促进肿瘤细胞凋亡。     

小鼠卵泡发育不同阶段Egr-1、Gadd45α蛋白表达及相互关系

目的:探讨Egr-1、Gadd45α在小鼠卵泡发育不同阶段的表达及其相互关系。方法:选择不同发育阶段的昆明种小鼠卵巢,用免疫组化法检测不同发育阶段卵泡中Egr-1、Gadd45α蛋白的表达。结果:Egr-1、Gadd45α蛋白在卵泡不同发育阶段的卵母细胞及颗粒细胞中均有表达,而且随卵泡发育表达增强。卵泡不同发育阶段中卵母细胞及颗粒细胞中Egr-1、Gadd45α蛋白表达差异有统计学意义(P<0.05)。闭锁卵泡Egr-1、Gadd45α蛋白表达强烈,其表达强度明显高于各级生长卵泡。黄体及间质中亦有Egr-1、Gadd45α表达。同时Egr-1、Gadd45α在各级卵母细胞的表达有较强的相关性(rs=0.993,P<0.05)。结论:卵泡发育不同阶段Egr-1、Gadd45α均有表达,在卵泡发育后期和闭锁卵泡中强表达。提示Egr-1、Gadd45α在卵泡生长发育及闭锁过程中可能起重要的调控作用。     

人前列腺癌高低转移细胞株差异表达基因的筛选

目的：筛选高低转移能力人前列腺癌细胞株PC3M-1E8和PC3M-2B4间差异表达基因。方法：应用抑制性消减杂交（SSH）技术,对高转移能力人前列腺癌细胞株PC3M-1E8及其同源低转移细胞株PC3M-2B4进行2次消减杂交,第1次SSH实验,以PC3M-2B4细胞株为实验方,PC3M-1E8株为驱动方,构建正向消减文库。第2次实验则以PC3M-1E8株为实验方,PC3M-2B4为驱动方,构建反向消减文库。筛选出来的阳性克隆进行测序,并在GeneBank数据库中进行同源性比较后从中选取若干序列进行实时定量PCR验证。结果：2个消减文库共得到238个阳性克隆,从中各随机选取8个克隆测序并进行同源性分析,发现其中12条序列来自于11个已知基因,另外4条序列为新的未知功能的基因序列标签（EST）。结论：成功构建了高低转移力人前列腺癌细胞株的双向消减杂交文库。     

αv整联蛋白拮抗剂RGD肽对乳腺癌细胞增殖侵袭能力影响的研究

目的：研究αv整联蛋白拮抗剂RGD肽对乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MCF-7增殖侵袭能力的影响,探讨其在肿瘤靶向性治疗中的作用机制。方法：化学合成RGD肽,免疫细胞荧光技术检测RGD肽与MDA-MB-231、MCF-7细胞结合能力；MTT法检测不同浓度RGD肽对细胞增殖能力的影响；流式细胞学检测RGD肽处理对细胞周期和凋亡的影响；Boyden小室体外侵袭实验测定RGD肽处理后细胞迁移与侵袭能力的改变。结果：RGD肽与MDA-MB-231、MCF-7细胞均有特异性结合作用,15μmoI/L及更高浓度的RGD肽作用24h后细胞增殖能力显著降低(P＜0.01),细胞凋亡明显增加,细胞阻滞于G_0/G_1期,且RGD肽对细胞体外侵袭能力有不同程度的抑制作用。结论：RGD肽作为αv整联蛋白的一种拮抗剂,不仅具有药物、基因治疗载体的导向运输功能,更具有肿瘤的直接杀伤效应,是一种理想的肿瘤靶向性治疗药物。