癌基因治疗中的腺病毒载体的开发和应用(综述Ⅱ)

1.8 Ad载体分析的进展 在众多Ad载体分析方法中,有二种是最关键的:一是用于测定物理纯度,另一是用于评估有复制能力的Ad(RCA)的污染。因此,在Ad载体制备物中检测E1基因的存在就成了合乎逻辑的策略。Southern blotting和PCR方法也被用于该目的。PCR分析法在设计上包括了病毒序列扩增内对照,使用二对引物来同时扩增AdE1片段和载体主链。该对照的灵敏度可达到在10~9PFU中检测出一个PFU的RCA。检测RCA生物学分析的设计则可在病毒及DNA水平上检测出rAd的复制能力~(17)P~(32)     

hGM-CSF基因的克隆及重组腺病毒的构建

目的采用RT-PCR技术、基因重组技术及脂质体转染技术等克隆得到hGM-CSF基因并获得高滴度重组腺病毒.最终目的是为GM-CSF造血干细胞肿瘤基因治疗提供基础研究准备.方法应用RT-PCR技术从人脐带血淋巴细胞中克隆出hGM-CSF基因,再应用基因重组技术构建含hGM-CSF基因的重组腺病毒载体,进而通过反复转染293包装细胞得到高滴度重组腺病毒.结果克隆出hGM-CSF基因,经测序证实结果正确;得到高滴度的重组腺病毒,提取病毒DNA证实含目的基因.结论用LoxP/Cre体外重组法成功构建了hGM-CSF的复制缺陷型重组腺病毒.     

蛋氨酸补偿代谢途径及蛋氨酸酶抗肿瘤研究进展

蛋氨酸是唯一1种含硫必需氨基酸,是蛋白合成和细胞转甲基化作用的必需成分,同时也是同型半胱氨酸的前体物质.研究发现,与正常细胞相比,肿瘤细胞对蛋氨酸呈现出依赖的特性.这种依赖是一种代谢缺陷,可从蛋氨酸的生物代谢角度解释肿瘤细胞产生蛋氨酸依赖的缺陷.正常细胞代谢中存在蛋氨酸补救途径即5,-甲硫基腺苷酸(MTA)循环合成蛋氨酸,而肿瘤细胞却无此途径,表现出对蛋氨酸的绝对需要.L-蛋氨酸γ-裂解酶能够特异性地裂解L-蛋氨酸产生氨、α-丁酮酸和甲硫醇.蛋氨酸酶在抗肿瘤研究中表现出对肿瘤特异性高,毒副作用小等特点,有较好的发展前景,给肿瘤基因治疗开辟了新的路径.     

切除GST标签的重组蛋氨酸酶及多抗制备

目的优化表达条件后纯化出切除GST标签的Met-PGEX-4T-1蛋白,制备出假单胞菌来源的多克隆抗体.方法将蛋氨酸酶(L-methionine gamma-lyase,Me)t的基因克隆至pBSK载体中,形成重组质粒pBSK-Met,采用基因工程技术将pBSK-Met与PGEX-4T-1载体连接,形成Met-PGEX.利用大肠杆菌表达系统诱导表达出Met-PGEX,采用亲和层析法过柱纯化Met-PGEX,凝血酶切除分子量为26KD的GST标签,免疫新西兰兔制备出蛋氨酸酶多克隆抗体Met PcAb,双向免疫扩散实验测多克隆抗体效价为1:128,间接Elisa法测效价1:1×105.结果成功表达纯化出纯度大于90%的Met-PGEX并制备出多克隆抗体.结论所制备的多克隆抗体可用于检测不同来源重组蛋氨酸酶抗原差异性变化.     

蛋氨酸酶肿瘤治疗的研究进展

肿瘤细胞蛋氨酸依赖性的增高是一种特异性的代谢缺陷,这种代谢缺陷也是选择性治疗肿瘤的一个靶点。研究发现,蛋氨酸γ-裂解酶(蛋氨酸酶、L-Methionine-γLyase)可以特异地裂解细胞内外的蛋氨酸,从而强烈地抑制肿瘤细胞的生长,并诱发其凋亡,但对正常细胞无影响,从而发挥抗肿瘤的作用。现在还发现,蛋氨酸酶消除体内的蛋氨酸,能够导致基因的甲基化作用和DNA合成发生改变,以增强抗肿瘤效果。动物研究和临床试验表明,蛋氨酸酶可以消除多种依赖蛋氨酸的肿瘤细胞,因此是一种蛋氨酸限制抗癌策略。蛋氨酸酶显示出作为一种新型的基因治疗方法的巨大前景。本文特对此做一综述。     

蛋氨酸酶联合顺铂协同抑制人肺腺癌细胞GLC生长作用

目的：纯化重组蛋氨酸酶并探讨其联合化疗药物顺铂对人肺腺癌GLC细胞生长的协同抑制效应．方法对原核表达体系pGEX-4T-1-Met/Dh5a菌液破碎后上清过纯化柱（GST）纯化后,采用MTT比色法测定重组蛋氨酸酶与顺铂联合应用对GLC细胞增殖的抑制作用,采用金正均法计算q值判断两药合用是否具有协同作用．结果重组蛋氨酸裂解酶浓度为0.22 mg/mL,纯度达95%,活性为0.568 IU/mg．给药72 h后单用顺铂对GLC细胞抑制率为24.80%,单用蛋氨酸酶抑制率为27.49%,两药合用抑制率为66.80%．=1.47＞1.15,表现出明显协同作用．结论蛋氨酸酶及顺铂均有抑制GLC增殖作用,并且两者联合使用存在协同作用．     

Effects of hCD80-Adenovirus on B16-F10 Cells

To study the biological characteristics of B16-F10 cells transduced with hCD80 gene in vitro, a kind of replication-deficient recombinant adenovirus bearing hCD80 gene (hCD80-rAd) was constructed and several means were utilized to observe the changes of biological characteristics after gene transduced.     

A－LAK细胞与LAK细胞体外增殖及抗肿瘤作用的比较

本实验观察了Ａ－ＬＡＫ细胞的体外扩增及其抗肿瘤作用，并与ＬＡＫ细胞进行了比较。结果表明，Ａ－ＬＡＫ细胞在短期内大量扩增，在培养第７天时达到增殖高峰，Ａ－ＬＡＫ细胞增加１２．０２倍，而ＬＡＫ细胞增加２．６９倍，培养３周后Ａ－ＬＡＫ细胞增加５３．５０倍，而ＬＡＫ细胞仅增加４．４５倍。１８小时ＬＤＨ－Ｌ释放试验表明，Ａ－ＬＡＫ细胞对Ａｎｉｐ９７３和Ｋ５６２细胞均显示较高的杀伤活性，与ＬＡＫ细胞相比有显著差异（Ｐ＜０．０５）。通过ＦＡＣＳ细胞表型分析显示，Ａ－ＬＡＫ细胞大量表达ＣＤ１６、ＣＤ５６抗原，提示Ａ－ＬＡＫ细胞可能来源于ＬＧＬ－ＮＫ细胞群。     

应用改建的cDNA表达质粒在哺乳动物细胞进行人IL—4高效…

人工合成人ＩＬ－４ｃＤＮＡ５＇末端３０个碱基序列作为探针，并将其与建立的基因文库进行克隆杂交，获得人ＩＬ－４ｃＤＮＡ片段。将该片段插入πＨ３Ｍ质粒并在猴ＣＯＳ细胞获得表达，再从质粒ｐｄＫＣＲ和ｐｄＢＰＶ－１出发构建了新的表达质粒ｐｄＢＨｈＩＬ－４，经磷酸钙沉淀法导入小鼠Ｃ１２７细胞获得成功转化的细胞克隆，该克隆细胞可高效地分泌ＩＬ－４活性多肽。改进细胞培养方法，有利于产物的提取和纯化；另外，应用测