百香果茎基腐病菌分离鉴定与药剂筛选研究

为研究百香果产业中多发病害茎基腐病的病原菌鉴定与防治问题,在广东省百香果主产区采集茎基腐病病株,结合形态学观察与分子测序方法鉴定分离病原菌菌株,并对其进行致病性检测,同时检测系列杀菌药剂对病菌生长及其致病性的影响。结果表明,通过形态特征观察、分子生物学鉴定,从百香果茎基腐病病株中分离获得的8个菌株鉴定为腐皮镰刀菌(Fusarium solani)。离体和活体致病力测试结果显示,致病力较高的菌株为FP6、FP7、FP2,其次为FP1、FP3、FP8、FP4,最低为FP5。不同药剂处理对病菌的生长及致病力均产生影响,其中30%苯甲嘧菌酯处理的抑制效果为最佳。研究结果可为后续百香果茎基腐病病理学、百香果抗病育种等研究提供基础。     

利用横向薄层培养技术建立番木瓜植株再生体系

建立一个高效稳定的植株再生系统是番木瓜生物技术育种和品种改良的关键。本研究通过横向薄层培养技术,以‘一尺瓜’番木瓜品种为材料,通过对田间成年结果树截干后萌生的侧芽进行消毒处理,经过初代培养和增殖培养后获得大量丛生分化芽。以健壮分化芽为材料横向切取1~2.5 mm厚度的薄层6~10片,经不定芽诱导和增殖培养后进行生根培养,成功获得植株再生。研究结果表明,采用300 mg/L利福平溶液浸泡并在摇床上140 r/min振荡处理1 h、75%酒精处理30 s、0.1%的氯化汞溶液(W/V)处理7~8 min的组合递进式消毒处理方法,可使侧芽接种培养成功率达到85%以上。分化芽薄层在MS培养基+30 mg/L蔗糖+0.1 mg/L6-BA+0.2 mg/L NAA+0.3 mg/L KT+0.1 mg/L IBA的条件下诱导培养20 d,单个分化芽切取的薄层平均可获得7.04个不定芽,其中第3号薄片出芽能力最强,平均出芽数可达到3.4个,最高5.0个。采用将叶尖代替分化芽茎基部插入培养基的茎段悬空植叶促根方法进行分化芽的促根培养,生根培养基组成为1/2MS培养基+3%蔗糖(W/V)+2 mg/L IBA,20~25 d后平均出根率可达到87.5%,根系无结构疏松和愈伤化现象,假植成活率可高达95%以上,有效改善了常规生根技术存在的根系质量差和假植成活率低的问题。本研究结果可提高番木瓜组培快繁效率,并为番木瓜诱变育种和分子育种提供技术支撑。     

香蕉枯萎病菌新毒素——白僵菌素的鉴定

 调查并分离了广东、海南、广西、福建和云南等香蕉枯萎病疫区的一批病原菌样本。利用高效液相色谱—电喷雾离子阱质谱（HPLC-ESI-MS）法对所分离的28个Fusarium oxysporum f. sp. cubense菌株的次生代谢产物进行初步分析。发现了分子量为179 D的镰刀菌酸及分子量约为783 D的未知产物;利用¹H-NMR对一株4号生理小种的未知产物进行了结构测定,结果表明该化合物为白僵菌素。离体试验表明白僵菌素能够导致香蕉假茎腐烂。     

番木瓜成熟过程中全基因组DNA甲基化和转录组变化分析

采用全基因组DNA甲基化(WGBS)和转录组测序(RNA-seq)技术对番木瓜4个成熟时期(绿熟期、破色期、熟化期、腐熟期)的果实样品进行高通量测序.C位点、CG、CHG和CHH序列平均甲基化水平分别为17.15％、49.33％、34.30％和8.28％.全基因组DNA甲基化水平在果实成熟过程中持续下降,同时差异表达基...     

复合菌剂对香蕉茎秆堆肥中微生物和养分含量的影响

为了有效利用香蕉废弃茎秆资源,采用复合发酵菌剂接种香蕉茎秆,研究外源微生物对堆肥的影响。结果表明：接种复合菌剂可以增加堆体中微生物总数,在堆肥初期能够激发微生物数量,快速启动堆肥发酵,缩短堆肥进程。在堆肥化过程中,细菌数量均明显高于真菌和放线菌数量。其中,在堆制初期细菌数量比真菌数量高2~3个数量级,比放线菌高1~2个数量级。添加复合菌剂可以加速堆体升温,促使堆肥提前达到高温期,并延长高温持续时间,从而加速堆肥过程。与对照相比,堆肥腐熟时间缩短7天左右。添加复合菌剂还可以有效增加全氮、有效磷及速效钾的含量,特别是速效钾含量增加幅度大,比堆制前增加了86.8%。     

香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立

【目的】建立香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系,为在香蕉上利用CRISPR/CAS9技术开展香蕉基因功能研究和香蕉育种工作开辟新的路径。【方法】根据香蕉A基因组八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2确定合适的CRISPR/Cas9靶标序列,选择其中一个位点作为靶标位点,设计包含靶标基因MaPDS序列的sgRNA。利用一套改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以pYLg RNA-Lac Z-U6a质粒为模版,Overlapping PCR法构建U6a-sgRNA表达盒,再利用Golden Gate Cloning法将U6a-sgRNA表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9载体中,构建以MaPDS为靶标基因的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。构建的质粒含Cas9p和sgRNA表达盒,其中Cas9p由P_(Ubi)启动子驱动,sgRNA由水稻来源的RNA启动子U6a驱动。将构建好的载体转入农杆菌EHA105,转化香蕉主栽品种巴西蕉胚性细胞悬浮系,获得抗性再生植株。设计PCR引物扩增包含靶标序列的MaPDS序列片段,检测和分析再生植株MaPDS被编辑的情况。【结果】试验选择MaPDS作为CRISPR/Cas9靶标基因,设计一个靶标位点,利用Overlapping PCR法获得了U6a-sgRNA表达盒,利用Golden Gate Cloning法将其克隆到pYLCRISPR/Cas9的Bsa I位点,成功构建了针对MaPDS的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。经过农杆菌浸染、抗性筛选、抗性胚诱导、萌发及生根,最终获得抗性独立转化株系129个。其中,71个株系出现白化表型,产生白化表型的几率达55%。失绿突变体的出现意味着MaPDS蛋白功能丧失。随机取转化株系中的白化表型株系33个和正常表型株系14个,提取其叶片基因组DNA,扩增含有MaPDS的靶位点片段,序列分析结果表明,白化表型株系的MaPDS靶位点序列发生了基因编辑。主要是在靶位点附近增加1个碱基T或A,或是在靶位点附近或下游发生碱基颠换或转换,出现非靶标位点突变。这些突变形式均能导致MaPDS蛋白翻译错误,从而使MaPDS蛋白丧失功能,表现为白化。转化株系中表型正常植株的MaPDS靶位点序列与野生型一致,未检测到变异。【结论】成功在香蕉体内实现了对内源MaPDS的定点敲除,获得了基因定点敲除的突变体株系,为进一步利用基因编辑技术在香蕉上的应用奠定了基础。     

番木瓜两性株高温条件下花性转变的转录组分析

【目的】探索番木瓜两性株高温条件下花性转变的分子机制，筛选花性调控相关基因，为培育耐高温番木瓜新品种提供理论依据。【方法】以在高温环境（39～40℃）下采集的番木瓜两性株的雄花（雌蕊退化）和两性花（完全花）为试验材料，利用高效液相色谱法测定两者内源激素含量，利用RNA-seq技术分析两者间的差异表达基因，并通过qRTPCR进行验证，用Plant CARE在线软件分析花发育相关基因启动子顺式元件。【结果】两性花乙烯合成前体1-氨基环丙烷羧酸（ACC）、吲哚-3-乙酸（IAA）、反式玉米素（tZ）、水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）含量显著高于雄花，两者脱落酸（ABA）和赤霉素A3(GA3)含量无显著差异。从转录组数据中共获得27 793个表达基因，筛选到517个差异表达基因（DEG），其中214个基因在雄花中上调表达，303个基因下调表达。这些差异表达基因主要富集到转录与调控、植物激素响应与信号转导、细胞分化与器官生长调控、质膜组分、氧化应激等GO条目和植物激素信号转导、植物-病原体相互作用、促丝裂原活化蛋白激酶信号通路等KEGG通路上。通过基因功能注释，筛选到70个植物激素信号转导、响应、...     

番木瓜胚性细胞悬浮系高效遗传转化体系的建立

【目的】建立番木瓜高效遗传转化体系，为番木瓜基因功能研究和重要农艺性状改良提供新的技术支撑。【方法】以紫晖番木瓜胚性细胞悬浮系（embryogenic cell suspensions,ECS）为遗传转化受体，利用植物表达载体pCAMBIA1301和农杆菌介导法进行遗传转化，对抗生素浓度筛选、侵染时间、继代培养、抗性胚的诱导与萌发以及植株再生整个过程进行探索，最后获得抗性再生植株。【结果】通过设置不同浓度的头孢霉素和潮霉素处理，观察ECS细胞状态，筛选、确定头孢霉素和潮霉素最适处理质量浓度分别为200 mg·L-1和5 mg·L-1。工程菌和ECS共培养侵染2 d后转到含有头孢霉素和潮霉素的液体筛选培养基上进行继代培养，继代周期为14 d。经GUS染色验证，表明继代3次后的ECS几乎全部为转化细胞。将以上ECS转移到液体胚诱导培养基中进行培养，2个月后可获得大量球形体细胞胚，且GUS组织染色为蓝色。将球形体细胞胚转到半固体成熟培养基上培养，2个月后可获得成熟子叶期体细胞胚。子叶期体细胞胚在萌发培养基上光培养30 d后，可获得再生芽。任意选取再生芽进行GUS染色，均可染成蓝色。抗性再生芽...     

矮生香蕉品种特性及栽培技术研究

矮生香蕉品种可在南北方发展温室栽培,是优良的经济树种与观赏树种,研究矮生香蕉的品种特性与配套栽培技术,可为发展矮生香蕉的观赏与鲜食应用提供基础和指南。试验选取了矮生香蕉品种‘中蕉12 号’为材料,评估其枯萎病抗性,开展地培及盆栽试验研究其栽培特性,总结其温室栽培技术要点。试验结果表明,矮生香蕉‘中蕉12 号’株高仅为85.7~103.3 cm,树形矮小,树姿优美,生长期较短约为10 个月,与易感品种‘巴西香蕉’相比具较强枯萎病抗病性,产量适中（6.0~7.8 kg/株）,品质优良,果实品质媲美常规鲜食品种‘巴西香蕉’。矮生香蕉品种‘中蕉12 号’可鲜食与观赏两用,用于休闲观光以及生态农业建设,具有良好的应用前景,符合现代都市农业的发展需求。     

香蕉种苗耗水规律及适宜节水灌溉制度研究

【目的】探讨香蕉育苗期的耗水规律,制定科学合理的节水灌溉制度。【方法】以‘巴西蕉’一级组培苗为材料,以椰糠为育苗基质,采用盆栽试验,设置6个水分上限(占田间持水率的百分比)处理:90%、80%、70%、60%、50%和40%(T90、T80、T70、T60、T50、T40处理),以100%相对含水率为对照(CK),每3天补水1次,测定了不同处理试验苗在苗期的日耗水量和生长生理指标。【结果】不同控水条件下的试验苗在整个苗期内单株日耗水量均呈上升趋势,各处理试验苗苗期总耗水量表现为:CK>T90处理>T80处理>T70处理=T60处理>T50处理>T40处理。在生长前期,T70处理的地上部指标的PCA得分最高,其叶片数和鲜质量分别较CK提高了16.67%和4.95%;在生长中期和后期,T80处理的得分最高,在生长中期,T80处理的茎粗和鲜质量分别较CK提高了15.64%和14.27%,在后期,茎粗和鲜质量分别较CK提高了34.62%和32.16%。根系的生长活跃度与基质相对含水率正相关,在生长前中期T80处理根系生长活力最强,而在生长后期T90处理根系生长活力最强。地上部与地下部异速生长模型为Y=0.1386·(x/r)0.7,R²=0.8076,模型评价的结果表明模型具有预测能力。【结论】香蕉苗期的最优节水灌溉制度为:在生长前期控制基质相对含水率为70%,中期和后期为80%。