橡胶丛枝病PCR及核酸杂交检测研究

 橡胶丛枝病最早是1959年由马来西亚的Roger报道。1991年,中国热带农业科学院植保所陈慕容等人通过电镜和血清学的方法鉴定它是由植原体和RLO复合侵染引起的。     

广东烟草花叶病毒移动蛋白基因的cDNA克隆和酶切鉴定

根据已报道的烟草花叶病毒移动蛋白基因序列,设计合成一对特异性引物。以广东ＴＭＶ株系ＲＮＡ为模板,用ＡＭＶ反转录酶反转录合成ｃＤＮＡ第一链;在复性温度５１℃条件下进行ＰＣＲ扩增,获得了一条０．８Ｋｂ的特异扩增产物,与已发表的ＴＭＶＭＰ基因编码区８０３ｂｐ大小相近;并将之克隆于ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ（＋）质粒。限制性内切酶酶切分析表明,本研究筛选到的是含ＴＭＶＭＰｃＤＮＡ的正向插入组质粒。     

高粱花叶病毒Hcpro、CP和PIPO基因酵母双杂交载体构建及自激活验证

采用同源克隆技术获得侵染甘蔗高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的Hcpro、CP、PIPO基因片段.将该基因片段连接至pGBKT7载体,分别构建酵母双杂交诱饵载体pGBKTT-Hcpro、pGBKT7-CP和pGBKTT-PIPO,经PCR、酶切及测序鉴定,证明重组诱饵载体构建成功后,将重组质粒导入Y2H Gold酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用.结果表明,含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性.含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His营养缺陷平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对ADE2、HIS3报告基因无自激活作用.研究结果为下一步利用酵母双杂交系统检测与高粱花叶病毒Hcpro、CP、PIPO蛋白相互作用的甘蔗蛋白提供基础.     

香蕉束顶病毒海口分离物Rb蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗血清制备

应用PCR方法从感染香蕉束顶病毒的香蕉植株幼嫩假茎和叶片总DNA中克隆了Rb(Rb-binding-like protein)基因的编码区,将其插入原核表达载体pET-28b中构建重组质粒pET28b-Rb。转化重组质粒的E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为22.6ku,且主要以包涵体形式稳定表达。目的蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析纯化后免疫家兔并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的BBTV编码Rb蛋白发生特异性反应。间接ELISA法测定的抗血清效价大于1:250000。用抗血清对感病香蕉和健康香蕉进行检测,结果表明,抗血清对感病香蕉有很高特异性,最佳工作浓度为1:1500。     

蛋白质相互作用技术在热带植物病毒研究中的应用

蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein interaction)承载着生物体生命活动的各个过程,研究热带植物病毒中的蛋白质-蛋白质相互作用,不仅可以从分子水平揭示病毒蛋白质的功能,还可以揭示病毒在寄主细胞中的侵染机理,从而制定相关策略预防病毒的突然爆发或进行疾病治疗。而蛋白质相互作用研究方法已有50多年的历史,如早期的化学交联法;并且该方法的技术在不断地完善和更新,产生了一序列新的技术,包括酵母双杂交、GST pull-down,免疫共沉淀和串联亲和纯化等多种技术。由于本实验室在热带植物病毒研究中涉及了多种蛋白质相互作用技术,为此,本文总结热带植物病毒研究中常用的蛋白质相互作用技术。     

仙人掌总RNA 提取方法的改进与分析

利用亚硫酸钠分别与TRIzol试剂、RNA plant plus Reagent试剂、BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂、艾德莱EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂和OMEGA Plant RNA试剂结合的方法,均可获得高质量的仙人掌茎总RNA。反转录成cDNA,RT-PCR结果显示,5种方法提取的总RNA反转录后均能特异性扩增到matK基因。使用TRIzol试剂盒、RNA plant plus Reagent试剂盒和艾德莱EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒提取RNA质量相对较高,在cDNA以1∶100稀释时能检测到matK基因;而使用BioTeke多糖多酚植物总RNA提取试剂盒或OMEGA Plant RNA试剂盒时,灵敏度稍低,在cDNA以1∶10稀释时,能检测到目的基因。利用亚硫酸钠结合不同植物总RNA提取试剂盒进行比较研究,为后续制备仙人掌茎高质量cDNA文库及其分子生物学研究奠定基础。     

辣椒脉斑驳病毒CP基因的原核表达及其抗血清的制备

采用RT-PCR方法克隆了辣椒脉斑驳病毒文昌分离物（ChiVMV-WC）的CP基因,并将其连接到原核表达载体pET-30b（+）上,克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后将获得的重组质粒pET30b-ChiVMV CP转化大肠杆菌Rosetta（DE3）后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,获得的融合蛋白分子量约为38 kD。用Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析纯化的融合蛋白免疫兔子并获得抗血清。Western blot检测结果表明,抗血清与诱导表达的ChiVMV-WC编码CP蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附法（ID-ELISA）检测抗血清效价为1/106。通过对田间20个样品的ID-ELISA检测,证实了所制备的抗血清与ChiVMV病叶具有良好的反应特异性。     

海南香蕉条斑病毒的检测

香蕉条斑病毒(Banana streak virus,BSV)是香蕉上一种重要的病毒。本文运用血清学检测法和PCR检测法对海南主栽巴西蕉(Musa Cavendish,AAA)、粉蕉(Musa Pisang Awak,ABB)进行了BSV的调查检测。结果表明,参试无症状或症状各异的样品血清学检测结果均为阴性,说明这些被测品中可能不含有游离BSV粒子;上述样品中部分样品的PCR检测结果却为阳性,将PCR扩增的特异条带回收、测序和比对,显示确实扩增到BSV部分基因组序列。结合血清学检测结果,说明海南部分香蕉的基因组已经整合了BSV的基因组序列。     

寄生椰心叶甲绿僵菌的培养特性及ITS序列鉴定

测定了8株分离于自然罹病死亡的椰心叶甲虫体绿僵菌的培养特性并采用其ITS序列进行系统发育分析,结果表明:绿僵菌在以玉米粉作碳源,牛肉膏、蛋白胨作氮源的条件下菌丝的生长速率最快,产孢量最高;绿僵菌对温度和pH的适应范围较广,最适宜的生长温度是26～28℃,pH为6～7时,菌丝生长最快,孢子量最多,绿僵菌的致死温度为55℃.基于8个菌株rDNA的ITS1-5.8S-ITS2区域序列的系统研究结果表明,8个菌株均聚在金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)构成的分支中,明显可分成两群,HY-4、YP-6、SX-2、QH-4为一群,与标准菌株FI1091一AF135214接近,另一群为HK-5、SY-2、SS-2、WC-1,与标准菌株Mb5EF113340接近.     

辣椒环斑病毒提纯及抗血清制备

为获得高效、灵敏的辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus,ChiRSV）多克隆抗体,通过差速离心、密度梯度离心等方法首次对辣椒环斑病毒进行了分离纯化,并将获得的高纯度病毒粒子用于免疫新西兰大白兔,制备了该病毒的多克隆抗血清。获得的抗血清经间接法酶联免疫吸附测定（ID-ELISA）,效价高达1 ∶ 125 000,且特异性高,与黄灯笼辣椒中另一种亲缘关系很近的同属病毒辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus,ChiVMV）不发生血清交叉反应、可有效鉴别这2种Potyvirus病毒。获得的抗血清可用于ChiRSV的检测及后续实验,最适工作浓度在1 ∶ 5 000~1 ∶ 25 000之间。