肠出血型大肠埃希菌O157:H7Tir的表达、纯化及不同免疫途径对其免疫效价的影响

目的 克隆、表达和纯化肠出血型大肠埃希菌(enterohaemorrhagic E.coli,EHEC)O157:H7转位紧密黏附素受体蛋白(Tir),观察不同免疫途径对其免疫效价的影响,为EHEC O157:H7亚单位疫苗的研究提供了实验资料.方法 扩增tir基因,克隆到pET-30a(+)载体上,转化至大肠埃希菌BL21/DE3,诱导表达目的 蛋白,通过Ni-IDA亲和层析进行纯化;将重组蛋白Tir免疫小鼠,检测血清和粪便提取物中抗体效价.结果 双酶切和测序鉴定结果均显示重组质粒pET-30a (+)-tir构建成功.SDS-PAGE结果表明,目的 蛋白Tir在大肠埃希菌BL21(DB3)中得到表达.皮下免疫和鼻腔免疫小鼠,血清中均能检测到高效价的IgG类抗体,鼻腔免疫组小鼠血清和粪便lgA类抗体效价明显高于皮下免疫组.结论 Tir蛋白具有一定的免疫原性.

Abstract：

Objective To clone and express translocation intimin receptor(Tir)of enterohemorrhagic Escherichia coli(EHEC)O157:H7,and to analyze the effect of different routes on the induction of immunity to the recombinant protein.Methods The tir eucoding genes were amplified from EHEC O157:H7 strain guangzhou 246 genome,and genes were cloned into the vector pET-30a(+).The pET-30a(+)tir recombinant was transformed into E.coli BL21.and expression was induced bv IPTG.The expressed product was analyzed by SDS-PAGE and purified by Ni-IDA affinity chromatography.The immunized mice sera and fecal against the recombinant protein was detected.Resuits The length of the tir is 1677 bp,with the initiation codon ATG and the termination codon TAA.Double enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the recombinant expression plasmid pET-30a(+)-tir was constructed.The recombinant protein was expressed in Escherichia coli expression system,and was purified by Ni-IDA affinity chromatography.The mice were able to produce a high serum IgG antibody titer after both subeutaneous and intranasal immunizations.Meanwhile,the intranasal immunization induced serum and fecal IgA antibody titer was significantly higher than that of the subcutaneous immunization group.Conclusion Tir molecule is potential vaccine candidate for preventing EHEC disease.     

大肠埃希菌O157：H7Tir基因的生物信息学分析

目的扩增和测序肠出血型大肠埃希菌O157：H7 tir打基因,利用生物信息学预测分析其结构和功能特征．以探讨Tir作为疫苗候选抗原的可能性。方法利用PCR技术扩增fir基因并测序,应用生物信息学网站在线分析工具和vectorNTISUite软件分析Tir蛋白结构和生物学功能,预测B细胞抗原表位。结果该基因全长1674bp,编码558个氨基酸,蛋白质总体亲水性高,有稳定的理化性质。含有3个结构和功能域,两段穿膜结构,多个磷酸化位点,预测20个B细胞线性表位。结论Tir毒力因子是很有前景的疫苗候选抗原,为肠出血型大肠埃希菌O157：H7的疫苗研究提供了理论依据。     

褪黑激素对新生大鼠神经干细胞向神经元样细胞分化的影响

【目的】探讨褪黑激素对体外培养新生大鼠神经干细胞分化的影响。【方法】从新生SD大鼠室管膜下区分离依赖碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和表皮细胞生长因子 (EGF)生存的神经干细胞进行培养 ,原代及子代细胞鉴定后用于实验。实验细胞均在无生长因子而含 10mL/L胎牛血清条件下培养 ,经褪黑激素或Luzindole作用 1周后做免疫组织化学染色 ,比较Map2阳性细胞出现率。【结果】①依赖bFGF和EGF生长的神经干细胞体外呈集落样生长 ,表达抗原蛋白巢蛋白(Nestin) ,无生长因子培养基中可分化形成胶质原纤维酸性蛋白 (GFAP)、S10 0蛋白、微管相关蛋白 (Map2 )阳性细胞。②褪黑激素能够提高Map2阳性细胞生成率 (2 3 4 5 % ,2 1 82 % ) (P <0 0 1)。③褪黑激素膜受体竞争性阻断剂Luzindole可阻断高浓度 (10 0 μmol/L)褪黑激素促神经干细胞分化作用 ,但不能抑制低浓度褪黑激素 (10nmol/L)的作用。【结论】褪黑激素能促进神经干细胞向神经元样细胞分化 ,不同浓度褪黑激素可能存在不同的作用机制。     

多重耐药铜绿假单胞菌同源性分析及Ⅰ型整合子研究

目的 研究临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌的同源性,分析整合子在多重耐药铜绿假单胞菌中的分布情况及所携带耐药基因盒的信息.方法 收集广东省3家三甲医院临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌,采用ERIC-PCR法分析菌株的同源性;PCR扩增整合子及其可变区并测序分析.结果 80株多重耐药铜绿假单胞菌分为19个型别,主要的型别为S型(n=24)、P型(n=18)和R型(n=6);Ⅰ类整合子的检出率为43.75％(35/80),所检出的整合子可变区有8种类型,分别为aacA4、aadA4a、aac(6')-Ⅱ-aadA13-cmlA 8-oxa-10a、aadB-PSE-1、aadB-cmlA1、aacA 4-aadA2、aadA 6-orfD和aacA 4-catB8-aadA1.结论 某医院存在两个克隆群的多重耐药铜绿假单胞菌的院内传播和扩散.Ⅰ类整合子是介导铜绿假单胞菌多重耐药性的因素之一.     

实验技术队伍建设实践与分析

分析总结中山大学中山医学院实验技术队伍建设经验：建立激励机制,不断强化爱岗敬业、无私奉献的精神;强化岗位管理,实行考核和轮岗,打造精湛的实验技术;促进实验教师与实验技术人员协同发展,提升实验教学质量。     

血栓通注射液对犬脑循环的影响研究

目的：观察血栓通注射液（XST）对麻醉犬脑循环的影响。方法：杂种犬24条,随机分为对照组、血栓通注射液低、中、高剂量组,单次左侧股静脉滴注给药（匀速滴注15min）观察收缩压（SAP）、舒张压（DAP）、平均动脉血压（MAP）、心率（HR）、脑血流量（CBF）、脑血管阻力（CVR）和颈内动脉流量等指标的变化。结果：血栓通注射液10、20mg·kg^-1在静脉滴注给药后10—30min均能明显增加脑血流量和颈内动脉流量,降低脑血管阻力（P〈0．05）。各剂量组对血压、心率影响均不明显（P〉0．05）。结论：血栓通注射液能明显增加脑血流量和颈内动脉流量,降低脑血管阻力,具有改善麻醉犬脑循环的作用。     

新生大鼠海马区及室管膜下区神经干细胞的诱导分化：无血清培养条件下观察

背景:神经干细胞作为修复损伤神经组织的细胞源已引起学者的关注,如何有效的获取更多的神经干细胞逐渐成为重点解决的课题之一。目的:观察大鼠室管膜下区和海马回神经干细胞体外培养、传代和分化情况。设计:单一样本实验。单位:中山大学附属第三医院神经外科。材料:取出生后3dSD大鼠10只,雌雄不拘,由中山大学实验动物中心提供。巢蛋白抗体(兔抗大鼠)、神经微丝蛋白(NF-200)抗体(兔抗大鼠)、胶质纤维酸性蛋白抗体(小鼠抗大鼠)均购自Sigma公司。方法:实验于2006-09/12在中山大学基础医学院组织胚胎学实验室完成。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学要求。从新生大鼠海马、室管膜下区分离神经干细胞,采用DMEM/F12无血清悬浮的条件培养,同时在培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子代替血清中含有的分裂原,进行体外扩增培养、传代观察。主要观察指标:采用免疫荧光检测技术,通过检测神经干细胞表达的nestin、神经元细胞表达的神经微丝蛋白和星形胶质细胞表达的胶质纤维酸性蛋白,鉴定神经干细胞及其分化结果。结果:分离获取的细胞具有自我更新和增殖能力,原代及传代培养20代后,在倒置显微镜下仍保留典型的"细胞克隆球"特征,神经克隆球通过nestin免疫荧光染色,呈阳性反应。经诱导后,细胞克隆球细胞外迁贴壁生长,可分化为神经微丝蛋白阳性的神经元细胞和胶质纤维酸性蛋白阳性的星形胶质细胞。结论:实验分离培养出具有自我更新和增殖能力的神经干细胞,其可诱导分化为神经元样细胞和星形胶质细胞。     

维持性血液透析患者焦虑和抑郁状态与营养状况临床分析

目的：调查血液透析患者焦虑和抑郁症状的发生情况以及与营养状况的相关关系。方法：对来自五家医院的331例维持性血液透析患者进行综合主观性营养评估（ SGA）、Hamilton 抑郁量表及 Hamilton 焦虑量表测定,采用问卷调查、临床晤谈和病史查阅的形式,用 t 检验、χ2检验、秩和检验及描述性分析等对资料进行统计分析。结果：（1）调查对象中有222例（67．07%）有不同程度的焦虑,169例（51．06%）有不同程度的抑郁。（2）有30．82%的调查对象有不同程度的营养状况不良。（3）不同程度营养不良患者的焦虑、抑郁得分差异有统计学意义。结论：维持性血液透析患者焦虑和抑郁发病率高于国外水平,与国内研究的水平接近,患者的焦虑和抑郁状态与营养不良有直接的关联。     

HMME-PDT对CNE-2细胞增殖的抑制作用

目的探讨血卟啉单甲醚介导的光动力学疗法(HMME-PDT)对鼻咽癌CNE-2细胞的抑制作用。方法以血卟啉单甲醚为光敏剂,532nm激光为激发光源的光动力学疗法作用于鼻咽癌CNE-2细胞。细胞用5、10、20!g/ml浓度的光敏剂孵育2h后,用0.6、1.2、2.4、4.8、9.6J/cm2剂量的激光照射;激光功率密度为10mW/cm2。MTT法检测在HMME和激光两种变量下PDT对细胞活性的抑制作用;光镜观察PDT作用后细胞形态的变化;免疫组化法检测PCNA的表达。结果在HMME剂量为5!g/ml、10!g/ml及20!g/ml时,细胞的抑制率随着激光剂量从0.6J/cm2增加至9.6J/cm2而逐渐增加;并且和HMME及激光剂量密切相关;光镜观察结果表明PDT组与对照组相比细胞密度明显减少,细胞核浓聚、碎裂。免疫组化结果显示PDT作用后PCNA表达减少。结论HMME-PDT对CNE-2细胞的增殖有明显的抑制作用。     

褪黑激素对新生大鼠神经干细胞向神经元样细胞分化的影响

目的 探索褪黑激素对体外培养新生大鼠神经干细胞分化的影响。方法 从新生SD大鼠室管膜下区分离依赖碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)和表皮细胞生长因子（EGF）生存的神经干细胞进行培养，原代及子代细胞鉴定后用于实验。实验细胞均在无生长因子而含10mL/L胎牛血清条件下培养，经褪黑激素或Luzindole作用1周后做免疫组织化学染色，比较Map2阳性细胞出现率。结果 （1) 依赖bFGF和EGF生长的神经干细胞体外呈集落样生长，表达抗原蛋白巢蛋白（Nestin) ,无生长因子培养基中可分化形成胶质原纤维酸性蛋白（GFAP），S100蛋白，微管相关蛋白（Map2)阳性细胞。（2）褪黑激素能够提高Map2阳性细胞生成率（23．45％，21．82％）（P＜0．01）。（3）褪黑激素膜受体竞争性阻断剂Luzindole可阻断高浓度（100μmol/L）褪黑激素促神经干细胞分化作用，但不能抑制低浓度褪黑激素（10nmol/L )的作用。结论 褪黑激素能促进神经干细胞向神经元样细胞分化，不同浓度褪黑激素可能存在不同的作用机制。