NF-κB p50和p65蛋白保守结构域原核表达系统的建立

目的 为了获得具有DNA结合活性的人NF—κB p50和p65蛋白,建立人NF-κB p50和p65蛋白保守结构域的原核表达系统。方法 通过PCR法扩增获得人NF-κB p50和p65蛋白保守结构域的cDNA,后分别将其克隆到原核表达载体pET-22b( )上,转化E．coli BL-21,经诱导表达及包涵体的变性和复性处理,获得可溶性p50和p65,同时用Western—Blot鉴定NF-κB p50和p65蛋白的表达,EMSA实验检测NF-κB p50和p65蛋白的DNA结合活性。结果 构建了pET-22b／p50和pET-22b／p65原核表达质粒;p50、p65蛋白在大肠杆菌中的表达均为包涵体;变性、复性后得到了可溶性p50和p65蛋白,浓度达218μg／ml和158μg／ml;并证实可溶性p50和p65蛋白均具有DNA结合活性。结论 成功建立了pET-22b／p50和pET-22b／p65原核表达系统,获得了具有DNA结合活性的NF-κB p50和p65蛋白。     

福建省基层卫生人才队伍建设探索

2019年8月至10月,笔者随"福建省卫生健康人才队伍现状、发展预测及对策研究"课题组先后深入到福建省福州、宁德、三明、南平、漳州等设区市的基层医疗卫生机构,与当地卫生行政主管部门及县总医院、乡镇卫生院、村(社区)卫生所和疾控中心、卫生监督所相关负责人及专业技术人员代表进行了座谈交流,调研基层卫生人才队伍建设现状和面临问题,听取有关方面对加强基层卫生人才队伍建设的意见和建议。     

肾恶性血管周上皮样细胞肿瘤的临床病理特征

目的:探讨肾恶性血管周上皮样细胞肿瘤（PEComa）的临床病理特征、免疫表型及分子遗传学特点、诊断与鉴别诊断以及治疗方式。方法:通过深入学习2例肾恶性血管周上皮样细胞肿瘤的组织形态特点并复习相关文献,归纳该肿瘤的诊断和鉴别诊断要点、探讨其免疫表型和分子遗传学特征,总结现有的治疗策略。结果:2例分别发生在48岁女性及62岁男性患者,肿瘤直径均大于5 cm,均以上皮样细胞为主,体积大,胞浆丰富,嗜酸性,单核或多核,细胞异型性明显,可见大片坏死,核分裂象约(2~3)个/50 HPF。在例1中,可见丰富纤薄的间质血管将肿瘤分隔成巢状,腺泡样结构;在例2中,肿瘤囊性变,呈多囊性结构,囊壁由肿瘤细胞构成,上皮样细胞间可见梭形细胞区域。2例肿瘤HMB45均局灶阳性,MelanA弥漫强阳性,TFE3蛋白表达均阴性。在例1中,肿瘤细胞不表达肌源性标记（SMA、Desmin均阴性）;而在例2中,肿瘤的梭形细胞区域SMA和Desmin局灶阳性。结论:肾恶性血管周上皮样细胞肿瘤属罕见疾病,需对该肿瘤加强学习认识,避免漏诊和误诊,治疗主要以手术切除为主,术后多予随访,但预后较差,分子靶向的个性化治疗将成为趋势。     

人PD-L1真核表达载体的构建及结肠癌细胞稳定表达单克隆株的筛选和鉴定

目的:构建人程序性死亡配体1（PD-L1）重组质粒载体,筛选稳定高表达人PD-L1的结肠癌单克隆细胞株。方法:提取HCT116细胞总RNA,RT-PCR克隆PD-L1基因片段,将其重组至含有HA标签和Neo真核细胞筛选抗性的pcDNA3质粒载体上,转染HCT116细胞,倍比稀释8个细胞浓度至96孔板,G418筛选两周,挑取单细胞克隆,通过免疫印迹鉴定外源性PD-L1的表达;通过MTS、Transwell和软琼脂细胞克隆形成实验比较PD-L1低表达和高表达单克隆细胞株生长增殖、迁移和细胞克隆形成能力的差别;最后通过在两组细胞中过表达帽依赖性荧光素酶报告基因阐述造成上述表型的可能机制。结果:成功构建人PD-L1的真核表达载体,并筛选获得稳定高表达PD-L1的HCT116单克隆细胞株。功能研究初步证明PD-L1可促进细胞克隆形成能力、迁移和生长增殖。过表达PD-L1可使帽依赖性荧光素酶报告基因的表达上调约3~4倍,表明其机制部分为PD-L1可上调帽依赖性蛋白质翻译。结论:获得了PD-L1重组质粒载体及可用于后续功能研究的稳定高表达人PD-L1的HCT116单克隆细胞株。     

酵母双杂交随机环肽库的构建、鉴定与扩增

目的 :构建含 16个氨基酸的酵母双杂交随机环肽库。方法 :以PCR扩增人工合成的随机DNA模板 ,经BamHI和EcoRI酶切后 ,克隆入酵母表达质粒pGADT7GH ,构建酵母双杂交随机环肽库并检验其库容及随机性 ,扩增、抽提并纯化酵母双杂交环肽库质粒。结果 :构建了酵母双杂交随机环肽库 ,库容为 1.2 8× 10 7,氨基酸分布与理论频数无显著差异 ,并扩增获得大量高纯度的环肽库质粒。结论 :成功地构建酵母双杂交随机环肽库 ,并获得大量高纯度的环肽库质粒。     

核因子-κB活化参与Ox-LDL诱导人肾小球系膜细胞表达单核细胞趋化蛋白-1(英文)

目的：研究核因子-κB(NF-κB)在氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导的体外培养的人肾小球系膜细胞表达单核/巨噬细胞趋化蛋白-1(MCP-1)中的作用。方法： 采用凝胶迁移率变动分析检测NF-κB的DNA结合活性变化，以免疫组化观测细胞内REL P65的核转位，用细胞ELISA法检测细胞内MCP-1及IκBα蛋白含量变化。结果： 不同浓度(10、25、50、100 mg/L)Ox-LDL刺激肾小球系膜细胞均可引起细胞NF-κB的DNA结合活性增强，50 mg/L Ox-LDL活化MCs效果最明显(8.50±1.14，P＜0.01 vs control； P＜0.05 vs 10, 25和100 mg/L Ox-LDL)。Ox-LDL刺激MCs 30-240 min均可以活化NF-κB，60 min时相点活性最强(11.0±2.11，P＜0.01 vs control； P＜0.05 vs 30 min or 240 min)。以50 mg/L Ox-LDL刺激MCs 1 h后，细胞内IκBα蛋白水平最低(0.050±0.006，n=5,P＜0.01 vs control)，作用24 h MCP-1表达水平最高(0.331±0.016， n=5,P＜0.01 vs control)。NF-κB活化的同时伴有REL P65核转位。上述效应可被NF-κB特异性抑制剂吡咯二硫氨基甲酸酯(PDTC)所抑制。结论： Ox-LDL刺激人肾小球系膜细胞产生MCP-1是由NF-κB调控，NF-κB参与了脂质肾损害的发病过程。     

西多福韦对HeLa细胞增殖抑制作用的研究

目的 研究抗病毒药西多福韦(CDV)对HeLa细胞的增殖抑制作用.方法 采用MTT法分析CDV和阳性对照药顺铂(DDP)对HeLa细胞增殖活力的影响;利用细胞集落形成实验和Giemsa染色技术,观察CDV和DDP导致HeLa细胞凋亡情况;利用流式细胞仪观察CDV和DDP对细胞凋亡及细胞周期影响.结果 MTT法和细胞集落实验结果显示CDV能明显抑制HeLa细胞的增殖活性;流式细胞仪测定显示CDV和DDP使HeLa细胞阻滞于细胞周期的S期,并诱导HeLa细胞发生凋亡.结论 CDV对HeLa细胞具有明显的增殖抑制作用,并能诱导细胞凋亡,CDV有可能成为宫颈癌治疗的另一策略.     

Torque teno病毒评估移植免疫功能的研究进展

目前尚无理想标志物能真实反映实体器官移植受者的免疫功能状态。随着新物种的不断发现,宏基因组学在微生物领域,尤其是病毒学领域研究产生了许多新的见解。其中,细项圈病毒属(AV)因缺少某种疾病关联被称为“孤儿”病毒,在Anelloviridae家族中大量存在。Torque teno病毒(TTV)是最早发现和研究最多的人类AV病毒,也是人类病毒组中数量最多的真核病毒,受到广泛关注,可能是免疫功能的标志。本文将对TTV用于移植免疫领域的理论基础和临床应用现状进行综述。