2株间日疟原虫18SrDNA的克隆及其同源性分析

目的克隆间日疟原虫河南分离株与湖北分离株红内期18SrDNA,并进行同源性分析。方法采用PCR方法从间日疟患者血样DNA中扩增间日疟原虫18SrDNA,纯化后与pGEM．Teasy质粒连接,转化大肠埃希氏菌JMl09;阳性克隆质粒经双酶切鉴定后,进行序列测定,采用BLAST和MEGA4生物软件分析同源性。结果间日疟原虫18SrDNA扩增片段大小为998bp：阳性克隆重组质粒经双酶切鉴定,与预期结果相符;序列测定结果显示,河南、湖北2分离株间日疟原虫18SrDNA序列完全相同．与GenBank中报道的12株间日疟原虫相同序列进行比对,其同源性均大于99％：用邻位连接法（neigh—bor-joining,NJ）和非加权组平均法（UPGMA）2种方法构建系统发生树发现,河南分离株、湖北分离株与间日疟原虫X13926．1株遗传距离小．同属一个分支。结论克隆了间日疟原虫河南与湖北分离株红内期18SrDNA,该基因序列在不同地理株间遗传稳定。     

日本血吸虫Calpain疫苗候选分子抗感染的免疫机制

目的探讨日本血吸虫疫苗候选分子—钙离子激活的中性蛋白激酶(Calpain)的保护性免疫力和免疫保护性机制。方法用重组纯化的Calpain抗原免疫BALB/c小鼠,制备抗Calpain血清,抗Calpain血清与机械转化的日本血吸虫童虫和来自于同种鼠激活的嗜酸性粒细胞共同培养,观察细胞对血吸虫童虫的粘附及对童虫的杀伤效果;RT-PCR分析Calpain抗原免疫BALB/c小鼠一氧化氮激酶(iNos.eNos.nNos)mRNA的表达;ELISA分析免疫小鼠体外培养脾细胞产生的细胞因子IFN-γ和IL-4。结果重组Calpain抗原免疫小鼠后,产生了一个极高的抗Calpain特异性抗体,此抗体介导了同种鼠的嗜酸性粒细胞对日本血吸虫童虫的粘附,37℃、5%CO2培养48h后,33.8%的日本血吸虫童虫被杀死,与控制组14.5%的自然死亡率相比有一个显著性的增高(P<0.01);RT-PCR测定重组Calpain抗原免疫1周小鼠iNosmRNA的表达显著性的增强,培养24h脾细胞上清中IFN-γ浓度高于对照组。结论Calpain特异性抗体介导了对日本血吸虫童虫的细胞毒作用,Calpain抗原能够诱导IFN-γ的产生,提示Calpain诱导Th1的免疫应答反应来抗日本血吸虫的感染。     

深圳市2010-2011年人群土源性线虫感染状况调查

目的 了解深圳市土源性线虫人群感染状况,为制订防治措施提供科学依据.方法 选取3周岁以上常住居民作为调查对象,采集粪便标本,应用改良加藤厚涂片法(Kato-Katz)一送三检查蛔虫、鞭虫、钩虫、蛲虫等土源性寄生虫虫卵,分析其感染率和感染度.结果 在宝安、龙岗、福田、南山、光明5个区总计调查3 935人,感染人数19人,平均感染率为0.48％,其中蛔虫、鞭虫、钩虫和蛲虫感染率分别为0.13％、0.28％、0.05％和0.03％;蛔虫、鞭虫、钩虫感染者每克粪便算术平均虫卵数分别为242、81.6和120,均为轻度感染.5个区中感染率最高的是宝安区,为0.86％,最低的是福田区,为0.13％,各区感染率差异无统计学意义(x2=6.81,P＞0.05).男女平均感染率分别为0.56％和0.40％,差异无统计学意义(x2=0.59,P＞0.05).感染率以＜20岁(0.55％)、20～岁(0.60％)和30～岁(0.65％)这3个年龄组最高.结论 深圳市土源性线虫人群感染状况处于较低水平,感染率低于2001-2004年广东省人体重要寄生虫病感染状况调查水平.     

弓形虫RH株微线体蛋白MIC3基因的克隆与表达

目的 克隆和表达弓形虫微线体蛋白MIC3基因。方法 从弓形虫RH株分离总的RNA,反转成cDNA.根据MIC3基因序列,设计合成一对引物,用聚合酶链式反应（PCR）方法从弓形虫cDNA中扩增MIC3基因片段,插入pGEM-T载体,并转化大肠杆菌Top10,经PCR、双酶切、测序验证后,将MIC3基因片段定向亚克隆到载体pET-28a中构建原核表达重组质粒pET-28a-MIC3,重组子在E.coli BL21中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果 从弓形虫RH株cDNA中扩增出792bp大小的MIC3基因片段并诱导表达27 300 Mr的重组MIC3蛋白。结论 成功构建和表达了弓形虫pET-28a-MIC3重组质粒,为弓形虫病诊断抗原和疫苗的研究奠定了基础。     

深圳市1例输入性恶性疟死亡病例的流行病学调查

目的 对深圳市1例输入性恶性疟死亡病例进行流行病学调查分析,为科学防治恶性疟提供参考依据。方法 访谈收治医生和患者家属,收集分析该病例临床和流行病学资料。结果 该病例发病前在乌干达务工,2020年1月回国,回国后第10天出现发热、发冷、发汗、头痛、腹泻、全身酸痛等症状,发病第2天前往某民营医院就诊,拟诊为“感染性发热”,服药后症状未见好转。发病第3天进行血液检查,结果显示疟原虫,考虑“疟疾”,予将其转院治疗。入院后,给予蒿甲醚抗疟、抗炎、降颅压、脏器功能支持等对症治疗,然而病情进一步加重。发病第6天该病例因脑型疟、多器官功能衰竭而死亡。血涂片镜检查见恶性疟原虫,PCR基因鉴定为恶性疟原虫。结论 综合流行病学史、临床症状和实验室检测结果显示,这是1例输入性恶性疟病例,诊治延误是引起该病例死亡的主要原因。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白在pET原核表达系统中的表达与纯化

目的　构建能在pET原核表达系统中表达结核分枝杆菌ESAT -6蛋白的重组表达质粒 ,并对其表达产物进行纯化。　方法　用PCR方法从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组中扩增出ESAT -6基因片段 ,克隆至pMD18-T载体 ,PCR筛选阳性克隆并测序 ;用限制性内切酶消化后 ,目的片段亚克隆至表达载体pET -2 3a( ) ,构建pET -ESAT -6重组质粒 ,将其转化入大肠杆菌BL2 1(DE3 ) ;PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达 ;用His·BindTM柱亲和层析法纯化融合蛋白。　结果　从结核分枝杆菌H3 7Rv基因组DNA中扩增出ESAT -6基因片段 ,成功构建重组表达质粒pET -ESAT -6,SDS -PAGE显示表达产物分子量约为 6kD ,经亲和纯化后的ESAT -6重组蛋白纯度高 ,且能被结核病人血清所识别。　结论　利用pET原核表达系统成功表达和纯化了结核分枝杆菌ESAT -6重组蛋白 ,为结核病诊断抗原和疫苗研究奠定了基础。     

日本血吸虫感染者尿液中特异性IgG及亚类的检测

目的 研究日本血吸虫感染者尿液特异性循环抗体在日本血吸虫诊断上的应用。方法 采集类检确诊的日本血吸虫患者尿液，ELISA法测定尿液中抗日本血吸虫特异性IgG及亚类（IgG1，IgG2，IgG3）抗体；同时肝吸虫阳性患者尿液作为考核交叉反应样本，无寄生虫感染液作为阴性对照。结果 粪检阳性日本血吸虫患者尿液中抗日本血吸虫IgG抗体的检出率为81.0%（17/21），其中IgG1为81.0%（17/21），IgG2为19.0%（4/21），IgG3为23.8%（5/21），肝吸虫患者尿液中IgG1抗体与日本血吸虫抗原有25.0%（2/8）的交叉反应，IgG2和IgG3均未发生交叉反应。结论 日本血吸虫患者尿液中存在抗日本血吸虫的特异性循环抗体，肝吸虫患者尿液中的IgG1抗体与日本血吸虫抗原有一定的交叉反应；但IgG2和IgG3无交叉反应现象，提示尿液中的IgG抗体可以作为血吸虫感染的诊断，尿液中的IgG2和IgG3抗体可以作为日本血吸虫病的鉴别诊断。     

间日疟原虫海南株SSUrRNA编码基因的克隆及其序列分析

目的克隆间日疟原虫海南株红内期小亚基核糖体核糖核酸（SSUrRNA）编码基因片段,并进行序列特征分析。方法采用聚合酶链反应技术从海南间日疟患者血样DNA中扩增出间日疟原虫SSUrRNA基因片段,纯化后与pGEM-Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切和PCR鉴定后,进行序列测定,采用BLAST软件分析其特征。结果 PCR扩增出间日疟原虫红内期SSUrRNA基因特异性片段大小约为998 bp;阳性克隆重组质粒经双酶切及PCR鉴定与预期结果一致;核酸序列测定显示插入的SSUrRNA基因扩增片段,含有998个核苷酸,与GenBank中的间日疟原虫Sal 1株、Pv2008/TR/DEL株及El Salvador株相同序列进行比对,其同源性均大于99%。结论成功克隆间日疟原虫海南株红内期SSUrRNA编码基因序列,该序列在不同地理株间相对稳定保守。     

深圳市肾综合征出血热患者汉坦病毒基因特征研究

目的 研究深圳市引起肾综合征出血热(HFRS)的汉坦病毒主要型别及分子特征,为该市汉坦病毒的防制提供依据.方法 收集各医院送检HFRS患者急性期血清标本,提取血清中病毒RNA作为模板,采用逆转录-套式PCR扩增汉坦病毒基因组M片段G2区基因并进行序列测定,对汉坦病毒进行基因分型和同源性分析.结果 深圳市HFRS病例男性多于女性,患者发病年龄主要集中在20-60岁,其中20-49岁病例数最多,共发病242例,占发病总数的85.82％.从282例标本中用HTN型特异性引物扩增阳性4例,占1.42％;用SEO型特异性引物扩增阳性50例,占17.73％;总阳性率为19.15％.序列比较分析发现,深圳地区流行的SEO型汉坦病毒核苷酸序列的差异相对较小,其基因的离散度为0％-4.9％.从种系发生树看这些病毒分布在一个分支上,均为S2亚型.HTN型汉坦病毒的变异率较高,其基因的离散度为6.7％-21.0％,二例为H7亚型,二例为H9亚型,均为深圳市首次报道.结论 不同年份引起深圳地区HFRS的汉坦病毒仍以SEO型为主,且病毒变异较小,稳定性较高.首次发现HTN型病例存在.结合流行病学调查资料,证实HTN病例均为输入性病例.     

重组SARS冠状病毒N蛋白纯化与鉴定

目的分析重组SARS-CoVN蛋白的表达,并予以纯化。方法SDS-PAGE分析N蛋白的表达,于自动蛋白层析系统上,用His·BindTM柱亲和层析纯化。结果重组表达的N蛋白存在于裂解细菌上清中,分子量大小约49000u,N蛋白经亲和层析获得纯化,纯化蛋白能与病人血清反应。结论表明自动层析获得了纯化良好抗原性的N蛋白。