一起外轮群体性腹泻事件的实验室检测及分析

目的调查一起外籍船员群体性腹泻的原因,及时采取相应措施防止腹泻疫情进一步扩散,并防止对环境可能造成的污染。方法结合流行病学调查结果,采集腹泻船员的肛拭子、粪便样本,处理后利用实时荧光PCR法对样本同时进行沙门氏菌、霍乱弧菌、副溶血性弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7的检测;同时对以上样本进行增菌和分离培养;分离出的菌株进行生化鉴定和血清学分型。结果实时荧光PCR检测结果显示,14份样本(12份肛拭子、2份粪便)中13份沙门氏菌检测阳性,1份阴性,其他指标检测均为阴性;阳性样本中分离到的特征性菌落均符合沙门氏菌生化反应特征;血清学反应结果显示,以上菌株为沙门氏菌Ⅱ型。但从该外籍船上采集的食品、饮用水及环境样本中均未检出沙门氏菌。结论引起本次群体性腹泻事件的原因为沙门氏菌Ⅱ型感染。     

南方五省口岸蚊类携带虫媒病毒调查

[目的]掌握南方口岸蚊媒携带病毒的本底资料,为蚊传疾病的预防控制工作提供依据。[方法]采用电动吸蚊器人工法和捕蚊磁场自动法采集南方5省口岸各类蚊虫。采集到的蚊类超低温送至实验室,研磨处理后用荧光PCR方法检测登革病毒、乙脑病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒等重要蚊媒病毒,结果阳性的标本进一步进行PCR扩增和核苷酸序列测定分析;蚊标本研磨液同时用C6／36细胞进行虫媒病毒分离培养,出现细胞病变后分别用黄病毒科、甲病毒科各自的通用引物进行鉴定;对未能鉴定的未知病毒进一步用随机PCR方法进行扩增、克隆、序列测定、Blast搜索。[结果]从南方5省口岸采集到各类蚊虫12575只,鉴定后共分成254组。各组标本经荧光PCR方法检测,结果登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒均为阴性;检测到2份福建省来源三带喙库蚊的标本乙脑病毒核酸阳性,经乙脑病毒E基因引物PCR扩增、测序分析证实为GⅠ型病毒。254份标本经C6／36细胞分离培养出现42份细胞病变,用黄病毒科、甲病毒通用引物PCR扩增,均未得到特异片段。选取1份典型病变的细胞培养物进行随机PCR鉴定,结果发现了1种潜伏于C6／36细胞中的浓核病毒。[结论]南方5省口岸蚊媒中可能未携带登革病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、基孔肯雅病毒等重要蚊媒病毒,只有少量蚊虫携带乙脑病毒,蚊虫体内检测到的GⅠ型乙脑病毒属于福建省首次发现,出现病变的C6／36细胞可能是由自身潜伏的1种C6／36细胞浓核病毒引起。     

2例马来西亚籍输入性基孔肯雅热病例的实验室诊断

[目的]通过系统的实验室检测发现并确认2例输入性基孔肯雅病例。[方法]采用实时荧光逆转录（Realtime RT-PCR）、逆转录PCR（RT—PCR）检测方法对病人血清进行检测,并对RT-PGR扩增产物进行核苷酸序列测定。[结果]通过实时荧光RT—PCR、RT—PCR 2种实验方法在该病例标本中检出基孔肯雅病毒核酸;对RT-PCR扩增产物进行测序,测出的521个碱基与基孔肯雅病毒核酸序列比对,结果同源性高达99％。[结论]2病例为输入性基孔肯雅实验室确诊病例。     

广东国境口岸不同蚊种COI序列分析和分子鉴定方法

[目的]建立国境口岸不同蚊种的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）分子和氨基酸鉴定方法并分析其系统进化关系。[方法]设计1对扩增COI部分编码区的PCR引物，对广州机场、江门和湛江等国境口岸采集的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊等成蚊和实验室喂养的蚊幼虫进行PCR扩增和序列测定，分析COI核苷酸和氨基酸的系统进化关系。[结果]5种蚊种的COI基因扩增片断长度均为415bp，A＋T含量为68．77％-70．6％。同源性比较表明，不同蚊种间COI片断碱基变异颠换数都明显高于转化数，核苷酸序列及其编码的氨基酸序列同源性分别为85．1％-93．7％和92．0％-99.3％。COI核苷酸系统进化关系显示，所有蚊虫的COI分子鉴定与其形态学结果吻合，但骚扰阿蚊位于一单独的分支上，其亲缘关系与其它蚊种最远。COI基因编码的氨基酸系统进化与蚊虫形态学亲缘关系一致，库蚊属、伊蚊属、阿蚊属聚类为库蚊亚科，中华按蚊与其它蚊种的亲缘关系最远。[结论]建立的COI核苷酸和氨基酸鉴别技术可成功地应用于国境口岸范围内成蚊和幼蚊的属和种的区分，后者更能区分高级分类阶元亚科和正确反映蚊虫的系统发育关系。这可以弥补蚊虫形态特征信息量的不足等传统分类系统的缺点，为广东口岸和其它国境口岸范围内外来的或新发现的蚊种的鉴别提供了分子水平的技术依据。     

诺如病毒快速检测方法的建立及其在国境卫生检疫中的应用

目的:建立快速、特异的诺如病毒实时荧光RT-PCR与常规RT-PCR相结合检测方法,对人感染诺如病毒进行快速检测。方法:根据国外最新流行的诺如病毒核酸序列,设计并合成诺如病毒基因扩增引物及荧光标记探针,摸索最佳反应条件,制定出快速、灵敏检测诺如病毒核酸的实时荧光RT-PCR检测方法及常规RT-PCR检测方法。结果:实验证明,本方法将实时荧光RT-PCR与常规RT-PCR检测方法相结合,能在5 h内快速确认诺如病毒,检测灵敏度达到102拷贝/反应,具有快速、灵敏的特点,且具有较高的特异性和重复性。结论:本实验室利用本方法,首次在广州某国境口岸从外籍发热船员样本中检出5例输入性GGⅡ群诺如病毒。该方法对防止诺如病毒传入我国,保障我国国境卫生安全具有重要意义。     

广东国境口岸五种蚊种核糖体基因第2内转录间隔区分子鉴定方法研究

[目的]建立国境口岸不同蚊种的核糖体基因第2内转录间隔区（rDNA-ITS2）分子鉴定方法及其系统进化关系。[方法]针对蚊虫的rDNA核酸序列保守性，设计扩增rDNA-ITS2编码区的PCR引物，对广州机场、江门和湛江等国境口岸采集的致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊等成蚊和实验室喂养的蚊幼虫进行PCR扩增和序列测定，并与GenBank中已知蚊虫的rDNA-ITS2进行同源性比较和系统进化分析。[结果]不同蚊虫的rDNA-ITS2扩增片断长度不同，M2引物对致倦库蚊、三带喙库蚊、白纹伊蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊的扩增片断分别为447bp-520bp、432bp-438bp、527bp-586bp、439bp-448bp和644bp。序列分析和系统进化关系显示，尖音库蚊组和三带喙库蚊聚类为库蚊属，再与白纹伊蚊和骚扰阿蚊聚类为库蚊亚科，库蚊亚科再与中华按蚊进行聚类，分子进化与蚊虫形态学鉴定的亲缘关系保持一致。[结论]建立的rDNA-ITS2分子鉴别技术可成功地应用于国境口岸范围内成蚊和幼蚊的亚科、属和种的区分和确定系统发育关系。这可以弥补蚊虫形态特征信息量的不足等传统分类系统的缺点，对国境口岸范围外来的或新发现的蚊种的鉴别提供了分子水平的技术依据。     

新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法研究

目的:建立新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。方法:分析新疆出血热病毒核酸S片段序列的保守性,设计新疆出血热病毒实时荧光RT-PCR引物和探针。以体外转录后的RNA作为阳性对照模板,摸索出实时荧光RT-PCR检测的最佳引物浓度、探针浓度和反应体系条件,并进行灵敏度和特异性分析。结果:建立的新疆出血热病毒的实时荧光RT-PCR检测方法最佳反应体系为:正向引物CCHFV-FP终浓度250 nM,反向引物CCHFV-RP终浓度500 nM,探针CCHFV-Probe终浓度500 nM;扩增程序为:50℃10 min,95℃10 min;95℃5 s,57℃20 s 45次循环。该方法最低检测限约为2 copies病毒/反应,与森林脑炎病毒和汉坦病毒无交叉反应。结论:该方法灵敏度高、特异性强,适用于新疆出血热病毒的快速检测。     

国境口岸猴痘病毒实时荧光PCR检测方法的建立

〔目的〕建立快速、特异的猴痘病毒实时荧光PCR检测方法。〔方法〕制备猴痘病毒阳性样本,设计并合成相应的扩增引物及荧光标记探针,摸索最佳反应条件。〔结果〕本方法对模拟猴痘病毒样本的检测灵敏度达到102拷贝/反应。本方法快速、灵敏,并具有较高的特异性和重复性,可在3h内准确检测出猴痘病毒核酸。〔结论〕本方法适合国境口岸猴痘病毒快速检测,对防止猴痘病毒传入我国,保障我国的国境口岸卫生安全具有重要意义。     

输入性甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因变异分析

目的分析口岸输入性甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因特征及变异趋势,及早发现变异株。方法选取广东口岸入境人员中检出的64份输入性甲型H1N1流感阳性样本,对其病毒NA基因进行核苷酸序列测定。与2009年甲型H1N1流感代表株A/California/04/2009/H1N1的NA基因序列进行对比,对甲型H1N1流感病毒的NA基因进化树、核苷酸序列同源性、氨基酸序列的变异及蛋白分子结构变化等进行分析。结果 NA基因进化树分为3个分支,其中2009年、2010年病毒聚集成簇位于分支1,2011年病毒则与部分2010年检出的病毒位于较远距离的分支2和3。检出的1例病毒NA氨基酸的抗原决定簇上发生Y155H的变异,部分病毒NA蛋白在42位点上新增了一个糖基化位点,在68、386位点出现了糖基化位点的缺失。氨基酸G41R、V106I、V241I、N248D、I365T、N369K等位点的变异较为显著,但未见耐奥司他韦病毒的出现。结论甲型H1N1流感病毒NA基因已发生一定程度的变异。随着突变的不断积累,病毒极可能会通过改变其抗原性和耐药性,从而引起新的流行。     

黄热病现状分析及研究进展

黄热病是黄病毒科、黄病毒属的黄热病病毒引起的急性传染病,经蚊媒传播,主要发生在非洲和美洲地区,严重威胁人类健康。目前该病尚无特效药治疗,接种疫苗是最好的预防途径。虽然亚洲地区尚未发现黄热病,但随着全球经济的发展,国际间的人群交往更为便利,全球贸易一体化和都市化生活等因素使得病毒和传播媒介更易在各个国家之间传播。我国应长期保持警惕,及时预防、控制该病通过国境口岸传入。本文就黄热病流行病学、预防控制,以及疫苗研究等情况进行了综述。