抗汉滩病毒McAb可变区基因克隆及序列分析

目的克隆和分析抗汉滩病毒单克隆抗体(McAb)H7可变区基因.方法根据鼠源抗体可变区(V)氨基酸序列,设计合成一组抗体重、轻链可变区(VH/VK)简并引物.采用一步法提取McAb H7细胞总RNA,通过RT-PCR扩增V基因,并进行核苷酸序列测定和分析.结果通过RT-PCR成功克隆了H7可变区重轻链基因,序列分析表明均为开放阅读框,符合小鼠抗体框架结构,含有明确的4个骨架区和3个抗原决定簇互补区,与抗体二硫键形成有关的两个特征性半胱氨酸亦高度保守.同源对比表明,H7-VK长357 bp,编码119个氨基酸,属JK4重排;H7-VH长360 bp,编码120个氨基酸,属JH4重排.经GenBank查询证实为新基因,登记号为AY245601和AY245602.结论 McAb H7可变区基因的获得,为有目的地开展HFRSV基因工程抗体的遗传改造及体外亲和力成熟等研究奠定了基础.     

地高辛素标记探针检测HFRS病毒基因研究

本实验用聚合酶链反应与随机引物标记法制备地高辛素标记的肾综合征出血热病毒核酸M、S片段cDNA探针。DNA-RNA斑点杂交结果表明,该探针具有肾综合征出血热病毒的特异性,可检出10pgHFRSV-RNA。实验结果表明：抗原阳性鼠体螨10只组、5只组,抗原阴性鼠体螨10只组,游离螨50只组、10只组,抗原阳性鼠肺50mg、100mg组,所抽提RNA与探针杂交结果呈阳性,而抗原阴性鼠体螨5只组抽提RNA的探针检测结果呈阴性。     

肾综合征出血热患者外周血单个核细胞中病毒蛋白和病毒核酸动态变化的研究

为进一步研究肾综合征出血热（HFRS）病毒核蛋白（NP）、胰蛋白（MP）及病毒核酸在HFRS患者外周血单个核细胞（PBMC）中的动态变化,揭示HFRSV在患者PBMC中感染、增殖及消亡之规则,应用免疫细胞化学方法测定18例HFRS患者不同病目的95份外周血单个核细胞中的NP和MP抗原。结果表明：第3病日,即可在患者PBMC中检测到Np师和Mp;第3～5病日,病毒结构蛋白表达较强,6～10日明显变弱,第18病目逐渐消失。逆转录-聚合酶键反应（RT－PCR）检测HRFSV－RAN的研究发现,第3病日至14病日均能检测到病毒的存在。RT－PCR技术对临床的早期诊断和流行病学调查提供了一个快速敏感的诊断方法。     

抗人RBC血型B抗原双价小分子抗体基因的构建与表达

目的： 分离抗人红细胞血型Ｂ抗原单克隆抗体（ｍＡｂ） ５Ｄ１２ 可变区基因, 构建并表达其双价小分子抗体（ｄｉａｂｏｄｙ） 融合蛋白, 为用原核细胞生产抗血型Ｂ抗原工程抗体进行基础研究。方法： 设计合成抗体重、轻链可变区引物, 通过加端ＰＣＲ技术, 在ｍＡｂ ５Ｄ１２ ＶＨ 和ＶＬ基因两端引入连结短肽和适当的限制性酶切位点,体外连接构建５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 基因, 并将其克隆入融合表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ２ 中, 在Ｅ－ｃｏｌｉ ＴＧ１ 中表达。运用ＰＣＲ和双脱氧核苷酸链末端终止法分析其核苷酸序列。结果： ＤＮＡ 序列分析表明, ５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 基因全长为６９９ｂｐ;其中ＶＨ 长３５１ｂｐ , 编码１１７ 个氨基酸; ＶＬ 长３２４ｂｐ , 编码１０８ 个氨基酸, 两者以五肽连接头相连; 重组体表达产物经ＳＤＳＰＡＧＥ显示, ＧＳＴ５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 表达产物的相对分子质量（ Ｍｒ） 为５１ ０００ 左右, 与预期结果相符。光密度扫描结果表明, ＧＳＴ５Ｄ１２ ｄｉａｂｏｄｙ 融合蛋白占菌体总蛋白的２４－６％ , 表达产物主要以不溶性的包涵体形式存在。结论： 成功地构建并表达了５Ｄ１２ 双价小分子抗体基因, 在原核细胞中获得较高水平     

应用噬菌体展示技术筛选、鉴定抗汉滩病毒单克隆抗体的模拟表位

目的 :应用噬菌体 12肽文库筛选抗汉滩病毒单抗 (mAb)F3、B11的模拟配体肽 ,并对其免疫学特性进行初步分析。方法 :以纯化的mAb为筛选配基 ,进行噬菌体肽库的生物亲和淘选。用ELISA法鉴定筛选克隆的结合活性 ,对阳性克隆进行序列测定和分析。用动物免疫试验初步分析噬菌体颗粒展示的抗原肽的免疫特性。结果 :通过 3～ 4轮生物淘选 ,ELISA显示筛选到的多数噬菌体克隆均可与mAb特异性结合 ;与mAbF3结合的阳性克隆的氨基酸序列高度一致 ,均为 MHGP TKNQMWHT ,与HTNV/SEOVM蛋白G2区第 75 0～ 75 9位氨基酸具有较高的同源性 ;而mAbB11特异性的结合肽在氨基酸水平上表现出一定的多态性 ,其序列的基序尚未能确定 ;动物免疫试验表明 ,噬菌体肽抗原具有良好的免疫反应性和免疫原性 ,是天然病毒抗原较好的免疫原模拟物。结论 :获得了具有良好结合活性的模拟表位肽 ,为基于表位的HFRSV多肽疫苗及DNA疫苗的研制奠定了基础。     

猪链球菌2型四川人源分离株ZYH18纤连蛋白结合蛋白基因的克隆和序列分析

目的对2005年猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2，S．suis 2）四川资阳人源分离株ZYH18纤连蛋白结合蛋白（FBPS）基因进行克隆和序列分析。方法以ZYH18的基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增出纤连蛋白／血纤蛋白原结合蛋白基因片段，克隆于pMD-T18栽体，构建成载体pMD-T—fbps，转化到宿主菌TG1中，进行序列测定（GenBank登录号为DQ345444）。测序结果与实验室保存的其它7株猪链球菌2型临床分离菌株测序结果及GenBank提交序列AF438158进行编码区基因的同源性比对。结果成功克隆了实验室保存的分离于不同时间和地点的，包括ZYH18在内的8株S．suis2临床分离菌株的．朋加基因，并对其编码区基因进行了同源性比对。结论实验室保存的8株菌的FBPS编码区基因同源性高达100％，并不因分离时间和地点的不同而不同；与GenBank提交序列AF438158同源性为99％，存在两个氨基酸的差异。     

单克隆抗体是潜在的血型检定试剂

血型检定通常依赖多克隆抗血清确定个体红细胞的特性。虽然单克隆抗体提供了很大的希望,但实际应用于血型检定决非易事。然而它们已表明在鉴定红细胞抗原本身的特性方面是有用的。按惯例,将输血与血液学联系在一起。这种关系可能并不是输血实践中最重要的事情,因为这只是一种权宜的结合,不是有共同利害关系的匹配。输血实践几乎完全是以抗原抗体反应为基础,因此它的适当位置是在免疫学中。实际上,有人主张将输血包括在移植免疫的分支中,因为血液是一种器官,输血是能保证移植物存活的唯一实例。     

ELISA检测HFRSV特异性IgM抗体及其与RPHI、IF试验的比较

本文建立了酶联免疫吸附试验(ELISA)检验肾综合征出血热病毒(HFRSV)IgM抗体的方法(ELISA-IgM),与反向间接血凝抑制试验(2ME-RPHI),间接免疫荧光试验(IF-IgM)同时检测82例拟诊为HFRS患者血清中的IgM抗体。结果表明:ELISA-IgM试验特异性强,稳定性良好;比IF-IgM敏感12倍;与2ME-RPHI、IF-IgM的符合率分别为89.1%及93%,阳性检出率显著高于后两种试验;检测发病5天以内和9天以上的患者血清,确诊率分别为85%及100%。     

酶联免疫吸附试验检测单纯疱疹病毒抗原方法的建立

<正> 单纯疱疹病毒(HSV)是人类广泛感染的一种病毒,可引起角膜——结膜炎、龈口炎、皮肤生殖器疱疹、脑炎等疾病。目前,HSV感染的发病率逐步上升,引起人们日益重视。由于近来HSV感染药物治疗有一定疗效,因此,