鸡毒支原体强弱毒株荧光定量PCR鉴别检测方法的建立

为建立一种能鉴别鸡毒支原体(MG)强、弱毒株的快速检测方法,本研究根据GenBank中MG强毒株和弱毒株的基因组序列,选取特异性保守区序列设计了2对引物和2奈探针,分别用于强弱毒株和弱毒株的检测,优化反应条件,建立了能区分MG强、弱毒株的荧光定量PCR检测方法.该法特异性强,对鸡常见呼吸道病原体的反应均为阴性;灵敏度高,可检测到100拷贝/μL的模板;稳定性好,批内和批间试验Ct值的变异系数小.本研究建立的MG强、弱毒鉴别检测方法简便、快捷,为该病的防控与净化提供新方法、新思路.     

三种对虾病毒多重实时荧光PCR检测方法的建立

根据基因库中白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下及造血器官坏死病毒（IHHNV）和桃拉综合征病毒（TSV）的基因序列,设计了WSSV 、IHHNV和TSV的三对特异性引物和三条用不同荧光基团标记的TaqMan探针。对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能够同时检测WSSV 、IHHNV和TSV的三重实时荧光PCR方法。该方法特异性好,对WSSV 、IHHNV和TSV的检测敏感性分别达到20000、20和20000个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对WSSV 、IHHNV和TSV不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测这三个病毒。对保存的45份经常规PCR检测仅为WSSV 、IHHNV和TSV阳性的样品进行二重实时荧光PCR检测,结果都为阳性,其中2份为WSSV和IHHNV混合感染。本研究建立的三重实时荧光PCR方法用于WSSV、IHHNV和TSV的检测具有特异、敏感、快速、定量等优点。     

禽肾炎病毒与鸡细小病毒双重PCR检测方法的建立

为了同时检测禽肾炎病毒(avian nephritis virus,ANV)和鸡细小病毒(chicken parvovirus,ChPV),根据GenBank中ANV的ORF基因和ChPV的NS1基因的保守序列,设计筛选了扩增片段大小分别为511 bp和242 bp的特异性引物,通过反应条件优化、特异性和敏感性试验,建立了一种双重PCR检测方法。该方法最佳引物比例为ANV上下引物各0.4μL(20 mol/L),ChPV上下引物各0.6μL(20 mol/L);最佳退火温度为53.8℃;灵敏度可达到55 fg(ANV)和58 fg(ChPV);对常见鸡病病原体进行检测,结果全为阴性。本研究建立的PCR方法具有特异、敏感、快速、稳定的优点,可用于同时鉴别诊断ANV和ChPV的混合感染。     

奶水牛牛分枝杆菌的分离与鉴定

从患疑似结核病的广西奶水牛群中进行牛分枝杆菌的分离和鉴定。共收集了238份临床样品(鼻黏液及牛奶),病料经1.25 mol/mL NaOH溶液预处理后,接种罗氏培养基进行细菌分离。分离菌经进一步纯化后进行抗酸性染色并镜检,镜检后判为阳性的细菌再接种到鉴别培养基上进行鉴别培养,同时,应用PCR方法对镜检为阳性的细菌进行进一步的鉴别检验。结果收集的所有临床样品,经37℃培养后共获得细菌12株。这12株菌经抗酸性染色后镜检都为分枝杆菌阳性,进一步经鉴别培养基鉴定12株菌中有2株为牛分枝杆菌,其余均为非典型分枝杆菌。2株牛分枝杆菌经PCR方法鉴定得以确诊。     

副鸡嗜血杆菌16 S rDNA PCR检测方法的建立

根据副鸡嗜血杆菌的16 S rDNA基因序列设计一对特异性引物XZIC1和XZIC2,对6株副鸡嗜血杆菌进行PCR扩增。结果显示,该对引物对6株副鸡嗜血杆菌均扩增出与预期大小相一致的282bp片段,而对鸡毒支原体、禽巴氏杆菌、鸡传染性支气管炎病毒、鸡新城疫病毒、大肠埃希菌、鸡白痢沙门菌、禽流感病毒(H9)、鸡喉气管炎病毒及葡萄球菌等9种病原体的扩增结果均为阴性。该PCR敏感性结果表明,本方法可以检测到10pg的副鸡嗜血杆菌DNA模板。采用引物XZIC1和XZIC2,对分别用副鸡嗜血杆菌ctcc253、ctcc255、ctcc257、ctcc269株感染SPF鸡的临床病料DNA进行PCR扩增,均可扩增出单一的282bp的片段。     

牛支原体和牛病毒性腹泻病毒二重二温式PCR检测方法的建立

为建立一种牛支原体(Mycoplasma bovis,MB)和牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的快速鉴别诊断方法,针对MB的uvr C基因和BVDV的5'端非编码区(5'-UTR)保守基因序列,分别设计两对特异引物,并将三温式PCR扩增程序简化为二个温度梯度,建立了鉴别MB和BVDV的二重二温式PCR方法。该方法能同时扩增MB和BVDV,扩增产物大小分别为412和170 bp。特异性试验结果显示,该方法对参试的所有毒株只扩增MB和BVDV基因组,对其它牛病原体无扩增;敏感性试验结果显示,该方法最低能同时检测到104拷贝的两种目的核酸;干扰性试验结果显示,该方法能同时检测两个模板不同浓度的组合,试验结果不受模板影响。综上,本研究所建立的二重二温式PCR方法特异、敏感、快速、简便,可应用于MB和BVDV临床鉴别诊断和流行病学调查。     

南方不同季节育雏鸡舍主要环境因子的变化研究

试验以有窗封闭式笼养育雏鸡舍为对象,于2018年3月~2019年1月开展研究鸡舍内环境的温度、相对湿度、二氧化碳(CO2)、氨气(NH3)、硫化氢(H2S)、二氧化硫(SO2)浓度和细菌总数,并分析环境因子之间的关系。结果显示:不同季节育雏舍内环境温度满足鸡群正常需要,鸡群成活率超过97%。夏季舍内相对湿度达82.48%,并且料肉比高于春季、秋季和冬季。春季、秋季和冬季CO2浓度易超标,不同季节舍内白天温度均高于夜晚,而白天CO2浓度低于夜晚。不同季节舍内环境温度分别与相对湿度、CO2浓度呈负相关和正相关关系。试验表明:有窗封闭式育雏鸡舍内不同季节雏鸡生长发育良好,但夏季湿度过高,春季、秋季和冬季舍内CO2浓度高于标准。建议夏季应合理控制舍内相对湿度,春秋冬季注意平衡舍内的保暖和通风工作。     

禽呼肠病毒在鸡胚成纤维细胞系中的增殖规律

为研究禽呼肠病毒(ARV)在鸡胚成纤维细胞(DF1)上的增殖规律,将ARV S1133株接种至DF1细胞,连续传代3次后观察细胞病变(CPE),RT-PCR检测病毒核酸。结果显示,ARV S1133株对DF1细胞有很好的亲嗜性,并出现典型的CPE。按照Reed-Meunch方法测量7个时间点的TCID50,并绘制生长曲线。结果显示,ARV感染DF1细胞后的0h~12h为静止期,12h~48h为快速增长期,并在48h达到最大的病毒效价,TCID_(50)为10~(-8.9)/0.1mL,为进一步研究ARV的致病机理,以及在DF1上研制禽呼肠病毒细胞灭活苗提供参考。