表达外源基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆的构建及病毒拯救

为建立表达标记基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,本研究在PRRSV HuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将新城疫病毒(NDV)NP蛋白末端优势抗原区插入PRRSV NSP2蛋白的复制非必须区,经基因片段的克隆、拼接,构建了含有外源标记基因的感染性的PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ52+NP49。用限制性内切酶SwaΙ将psk-HuN4-F112-Δ52+NP49线性化后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法将病毒RNA转染叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)包装出病毒粒子,再转接到猴胚胎肾上皮细胞(MACR-145)传代拯救病毒。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(病毒基因组14667位人工产生的MluⅠ酶切位点)和插入的标记基因序列。间接免疫荧光试验表明,外源基因NP49在拯救的PRRSV中表达,且能够在PRRSV传代过程中稳定遗传。病毒生长特性比较显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了含有标记基因PRRSV的感染性克隆并获得了拯救病毒,为进一步开发新型PRRS疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。     

我国高致病性猪蓝耳病病毒的演化分析

自2006年以来,我国大面积暴发高致病性猪蓝耳病,但目前对其病原HP-PRRSV的起源还不得而知.本试验通过对多株HP-PRRSV进行全长基因组分析,发现HP-PRRSV中存在4处缺失,而且这4处缺失是逐步形成的,在中间过渡类型的毒株中存在着缺失1处、2处、3处的毒株.此外,中间过渡类型毒株中的一些氨基酸基序也是逐步变化的.本试验初步阐明了我国HP-PRRSV的起源是CH-1a-1ike PRRSV,在中间过渡的毒株中能够发现逐步演变的轨迹.     

通用型流感疫苗研究进展

疫苗免疫是目前防控流感病毒感染最有效的策略。现有流感疫苗在不同亚型间的交叉保护力较差,并且由于HA和NA蛋白存在抗原漂移和转换现象,极大地影响了现有疫苗的免疫保护效果,甚至导致疫苗免疫失败。而动物模型研究结果显示,基于流感病毒基因组保守区域的疫苗能够对不同型或亚型的流感病毒产生广谱的交叉保护,本文主要介绍基于M2e、HA和NP的通用型流感型疫苗研究进展。     

一种用高拷贝质粒载体制备BAC载体基本功能基因的新方法

介绍一种改进的用普通高拷贝质粒pUC119来制备细菌人工杂色体（BAC）载体基本功能基因序列的新方法及其在构建分子克隆化病毒中的应用,该方法可使BAC载体基本功能基因序列的制备更为简易、高效。     

猪繁殖与呼吸综合征重组核衣壳蛋白(N)-ELISA诊断方法的建立与应用

将猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离株ＣＨ－ｌａ的核衣壳蛋白基因定向克隆到ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＢ转移载体ＰＨ启动子下游,与苜蓿银蚊夜蛾多核型多角体病毒线性化ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞。获得能隐定表达核衣壳蛋白（Ｎ 蛋白）的重组杆状病毒。利用昆虫杆状病毒表达系统表达的猪繁殖与呼吸综合征病毒重组Ｎ蛋白作为抗原,包被聚苯乙烯微量反应板,建立了猪繁殖与呼吸综合征重组Ｎ蛋白－ＥＬＩＳＡ诊断方法。试验证明,该方法对其他８种猪疫病阳性血清均无交叉反应,对标准阳性样品的检出率为１００％,具有敏感性高、特异性强的特点。     

鹅源H5N1亚型禽流感病毒新疆分离株A／Goose／XJYL／10／2003HA基因的克隆和序列测定与分析

根据已发表的H5N1亚型禽流感病毒的HA基因全序列，设计了1对引物，对禽流感病毒新疆株A／Goose／）（JYL／10／2003（H5NI）提取RNA，经RT-PCR扩增后将其克隆到pMD18-T栽体上，获得长为1758bp的HA全基因序列。序列测定后。分析结果表明，本试验株与广东、香港和东南亚等不同地区的H5N1禽流感病毒HA的枉甘酸序列的同源率很高。其氨基酸切割住点附近具有高致病性禽流感病毒的特征。系统进化树分析表明，新疆株为独立分支，属于欧亚种系。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的研究进展

单克隆抗体在兽医领域的应用价值越来越受到研究人员的重视。本文概述了近年来猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）结构蛋白单克隆抗体的研究概况，以及它们在该病病毒分子生物学研究中的应用。     

暴发高致病禽流感疫区鸟类禽流感的血清学调查

本研究应用血凝抑制试验(H I),2004年初H 5亚型禽流感在中国内地发生前后,于湖北、广西二疫区市县的生态系中,自健康的鹰、鸽子、野鸭和鹌鹑中采集了54份血清,对其进行了血清学检测,并将获得的血清学检测数据进行了统计学分析。分析结果显示,在总共采集的54份血清样品中,抗H 6亚型禽流感病毒(H 6)抗体、抗H 9亚型禽流感病毒(H 9)抗体、抗H 5亚型禽流感病毒(H 5)抗体阳性率分别为64.8%、75.9%、29.6%。推断,这一时期,H 6亚型禽流感病毒(H 6)、H 9亚型禽流感病毒(H 9)和H 5亚型禽流感病毒(H 5)共循环于该生态系中,其中H 9、H 6亚型禽流感病毒长期、稳定循环于该生态系中,为该生态系禽流感主要流行血清型。血凝抑制试验检测结果发现,H 5亚型禽流感病毒抗体滴度较低,最高仅为640×,其阳性率为29.6%,推断其可能为新近传入的病毒或新近重组变异出现的新病毒,可能为与该次禽流感暴发相关的新病毒,这一推断还有待于通过对病毒基因序列的分析而做进一步验证。     

猪伪狂犬病毒变异毒株的特性及其疫苗的研究现状

正猪伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的高死亡率的急性传染病。该病在我国发生较为严重,是严重危害我国养猪业的疫病之一。我国于20世纪70年代从匈牙利引进了伪狂犬疫苗Bartha-k61株,自20世纪90年代以来国内规模化猪场普遍使用该基因缺失疫苗,使猪伪狂犬病得到了很好的控制。但是,自2011年以来,一种由伪狂犬病毒变异毒株引     

日本脑炎病毒NSl基因在大肠杆菌中的高效表达

提取日本脑炎病毒弱毒株SA14-14-2的基因组RNA，用RT-PCR扩增其NS1基因cDNA，将其克隆到原核表达载体pET-30b( )中，转化大肠杆菌BL-21（DE3）,经IPTG诱导，NS1基因获得高效表达。SDS-PAGE分析显示，表达的融合蛋白表观相对分子质量约为46000，重组NS1蛋白占菌体总蛋白的30.8%。Western blotting分析表明，重组蛋白具有良好的免疫原性。