猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)福建分离株核衣壳蛋白基因(N)的克隆与表达分析

猪传染性胃肠炎(swine transmissible gastroenteritis,TGE)是一种高度接触性肠道传染病,是我国法定检疫的疫病。为研究福建省猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)核衣壳蛋白基因(N)的分子特征及其原核表达产物的抗原性,参照GenBank中的TGEV全基因序列,设计合成一对扩增TGEV福建(FJ)分离株N基因的特异性引物,进行克隆和序列分析,结果表明,TGEV-FJ株N基因全长1149bp,编码382个氨基酸(GenBank登录号JQ700302),与国内外23株TGEVN基因的核苷酸同源性,氨基酸同源性进行比较分析,N基因核苷酸的同源性为95.4%～99.8%,氨基酸同源性为96.1%～100%。TGEV-FJ株N基因克隆至原核表达载体pET-32a中,并转化到大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白约为68kD,与预期分子量一致;Western blot分析表明,重组蛋白能与抗TGEV阳性血清反应出现特异性条带;以纯化的重组TGEVN蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性,送检20份猪(Sus scrofa)TGEV阳性血清样本中检出16份阳性结果、10份阴性血清样本中检出9份阴性结果。利用纯化的TGEV重组N蛋白免疫Balb/c小鼠,杂交瘤技术制备单克隆抗体,获得了1株特异性好并能稳定分泌抗TGEVN蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(命名为1-27),间接免疫荧光试验证明,该单抗能特异性识别TGEV全病毒抗原。TGEVN蛋白的单克隆抗体制备为建立TGEV免疫学检测方法提供了基础资料。     

禽脑脊髓炎病毒检测技术研究进展

禽脑脊髓炎是一种病毒性传染病,能引起雏鸡、雉、鹌鹑和火鸡感染,其特点是运动失调和快速震颤。文章就其检测技术,如病毒分离,血清学诊断和核酸探针等的研究进展做一阐述。     

禽类呼肠孤病毒的分子生物学

1病毒特性 禽类呼肠孤病毒(ARV)为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属的成员,与哺乳类呼肠孤病毒相比较,一方面具有共同的理化特性和形态特征:病毒粒子呈二十面体、无囊膜、直径约为60～80 nm.病毒基因组由10个基因节段组成的dsRNA,其核酸由双层蛋白质衣壳所包裹;另一方面自身还具有独特的生物学特性:(1)无血凝活性,能诱导细胞融合和多数毒株对自然宿主具有致病性.(2)血清学方法证实禽类呼肠孤病毒各毒株之间具有共同的群特异性抗原(与哺乳类RoeV无交叉抗原),但由于存在大量的交叉反应,有些群不能作为独立的血清型,故禽类呼肠孤病毒只能以抗原亚型存在.(3)通过对禽类呼肠孤病毒各代表株进行SDS-PAGE核酸电泳分析,禽类呼肠孤病毒的核酸电泳图谱明显有别于哺乳类呼肠孤病毒株,即使在禽类呼肠孤病毒株之间也存在明显的多态性,但目前尚未发现这种差异与血清型及致病性相关.     

番鸭呼肠孤病毒σC基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

应用RT-PCR方法扩增出番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的σC基因,通过XhoⅠ+HindⅢ双酶切后把该基因插入到经过同样双酶切的穿梭质粒pShuttle-CMV载体中。重组穿梭载体经过双酶切和PCR鉴定后进行测序,序列测定正确,同源性为99.8%。将获得的重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转染293细胞后获得重组腺病毒。PCR和RT-PCR鉴定的结果证明σC蛋白基因已成功插入到重组腺病毒载体中。     

伪狂犬病病毒(PRV)不同毒株抗原相关性研究

为了解PRV不同毒株之间的抗原性差异,评价弱毒FB株预防新型PRV的潜力,以4株PRV(FA、FB、Bartha-K61和FJ2012)毒株及其高免血清为材料,应用交叉中和试验测定PRV不同毒株的抗原性差异,通过FB免疫猪攻毒试验评价弱毒FB株对新型PRV的保护潜力。结果表明:中和抗体测定表明兔抗FB株、FA株、Bartha-K61株和FJ2012株高免血清的中和效价分别为1∶54、1∶91、1∶91和1∶215。交叉中和试验显示FB株与FA株、FB株与FJ2012株、FA株与FJ2012株的抗原相关性(R值)均大于0.8,Bartha-K61株与FA株、FB株、FJ2012株的R值均小于0.4,表明FB株与FJ2012株的抗原相关性高于Bartha-K61株与FJ2012株。仔猪免疫攻毒试验显示FB免疫猪能抵抗新型PRV(FJ2012株)的攻毒,保护率100%。提示PRV弱毒FB株有望成为预防新型猪伪狂犬病毒(FJ2012株)的疫苗候选株。     

番鸭呼肠孤病毒在番鸭体内的动态分布和排毒规律

应用RT-PCR技术检测番鸭呼肠孤病毒在人工感染番鸭体内的动态分布和排毒规律.结果显示在感染后ld可在肝、脾脏、法氏囊、胸腺和盲肠扁桃体中检出病毒RNA,表明病毒首先入侵免疫器官;随后其他器官中逐渐检测到病毒.高峰期为攻毒后7～14 d,所有器官中均能检测到病毒,此时也是病毒感染发病最严重的时间.感染后14 d,在肺和...     

鸡传染性喉气管炎病毒的分离和TK基因鉴定

从临床表现以呼吸困难、喉头出血为主要特征的某蛋鸡场患鸡喉头和气管等组织分离到一株病毒。该分离毒无血凝特性,应用检测ILTVTK基因的PCR能从分离毒中扩增出大小为427bp的特异性目的片段。测序结果与GenBank收录的ILTV不同毒株序列的同源性为100%。结果初步表明该分离毒为鸡传染性喉气管炎病毒(命名为ILTV-FJ)。     

番鸭源呼肠孤病毒YJL株σNS基因克隆和序列分析

参考GenBank上公布的禽呼肠孤病毒(ARV)和番鸭呼肠孤病毒(MDRV)σ非结构基因(σNS)序列设计合成一对引物,对番鸭源呼肠孤病毒YJL株σNS全基因进行RT-PCR扩增,克隆到pMD18-T载体中,并对克隆产物进行PCR鉴定和测序;YJL株σNS的编码基因位于S4节段,基因全长1192 bp,其5′端和3′端序列分别为5′-GCTTTT和3′-TATTCATC,具有典型的禽正呼肠孤病毒基因末端碱基序列;σNS基因只有一个有效阅读框(24-1127 bp),编码由367个氨基酸组成的σNS蛋白;σNS蛋白的分子质量约为40.57 ku,等电点(PI)为7.875.YJL株与法国MDRV-89026株σNS基因核苷酸的同源性为77.8%,推导氨基酸的同源性为90.2%;与ARV-S1133株σNS基因的同源性为99.4%,推导氨基酸的同源性为99.5%;系统进化树分析表明,YJL株σNS基因和蛋白与S1133株的亲缘关系更近,处在ARV分支上.可见,番鸭源呼肠孤病毒YJL株属于ARV,同时也表明我国发病番鸭群中存在不同基因群的呼肠孤病毒感染.     

猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank上发表的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)基因序列,针对TGEVN基因全序列设计合成了一对引物,以TGEV疫苗株为模板,建立了检测TGEV的RT-PCR方法。应用该方法对TGEV疫苗株RNA进行扩增,获得与预期大小相符,长度为1168bp的特异性目的片段;测序结果与已报道的TGEV不同毒株的序列同源性达到95%～97%;敏感性测定该RT-PCR可扩增到18pg的TGEV-N-cDNA;对猪传染性胃肠炎(TGE)的病料进行RT-PCR鉴定,可检测出TGEVN基因片段。结果表明建立的RT-PCR方法对TGEV的检测敏感性高、特异性强,可用于TGEV感染的诊断和流行病学调查。     

应用RT-PCR检测人工感染番鸭体内番鸭呼肠病毒的动态分布

应用RT-PCR技术检测番鸭呼肠病毒在人工感染番鸭体内的动态分布情况.结果显示,1日龄感染番鸭呼肠病毒MW9710株,3 d后就可以从肝、脾等组织中检出病毒RNA,直到32 d不能从组织样品中检测到病毒RNA,检出高峰期为感染后7 d～14 d.在6种不同组织中均不同程度地检测到病毒核酸,其中以肝脏组织检出率最高(68.9%),其次为脾脏(62.2%)、心(48.9%)、肾(46.7%)和胰(35.6%);肛门棉拭子的检出率最低(17.8%),显示了番鸭呼肠病毒在感染机体内的动态分布情况.