猪“O”型口蹄疫基因工程苗免疫猪的免疫效力、安全性及抗体消长

对猪“Ｏ”型口蹄疫基因工程疫苗进行免疫效力和安全性的观察,同时检测了免疫猪的抗体消长。结果表明,该基因工程疫苗对猪体是安全、有效的。免疫猪抗体乳鼠中和指数在免疫后４个月仍可达２．０,血凝价仍达２７．５。     

用3AB-ELISA鉴别猪口蹄疫病毒感染与疫苗免疫猪的研究

采用大肠埃希氏菌表达的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3AB(FMDV-3AB)多肽为抗原，A／G蛋白-辣根过氧化物酶为酶结合物，过氧化氢-四甲基联苯胺为底物溶液，建立了一种可鉴别FMD感染与灭活疫苗免疫猪血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(I-ELISA)，即3AB-ELISA。通过对1779份健康猪、免疫猪及人工感染猪血清的检测，确定了该I-ELISA的阳性/阴性判定临界值。该检测方法比VIAA-AGID法检出率高，尤其是采用A／G蛋白酶结合物后操作更简便。     

O型口蹄疫病毒VP1 T细胞、B细胞表位双拷贝基因与大肠杆菌LTB基因融合表达产物的免疫应答

[目的]为预防口蹄疫与幼畜腹泻、生产安全高效的基因工程联合疫苗提供试验依据。[方法]通过基因工程技术,把O型口蹄疫病毒VP1双拷贝21-40(20aa)与141-160(20aa)表位肽基因——2020VP1与产肠毒素大肠杆菌LTB连接到表达载体上,在大肠杆菌中表达出具有抗O型口蹄疫病毒与产肠毒素大肠杆菌双重作用的融合蛋白。[结果]运用基因工程技术构建了融合表达载体r2020-B-2020。转化宿主菌BL21(DE3)RIL后的表达产物经SDS-PAGE分析,结果显示,重组融合蛋白的分子量约为41 kD,表达量较高。动物实验表明,融合蛋白能够诱发兔体产生较强的抗FMDV中和抗体,免疫豚鼠在低浓度FMDV刺激下产生特异性T淋巴细胞增殖反应,说明融合蛋白可以诱导机体产生有效的抗FMDV细胞及体液免疫反应。融合蛋白能够与霍乱毒素CTB抗体特异结合,免疫雌鼠能够抵抗一定强度的大肠杆菌毒株攻击。[结论]融合蛋白可以同时诱导机体产生较好的抗FMDV及ETEC免疫应答反应,具有开发成为FMDV与ETEC基因工程疫苗的应用价值。     

大肠杆菌热不稳定肠毒素无毒突变体LTR72基因重组质粒的构建

用PCR方法扩增大肠杆菌LT基因，将LT基因重组入pET32a质粒载体，对构建的重组质粒pET-LT进行酶切、核苷酸序列分析，结果表明，插入片段LT的核苷酸序列与预期一致，且阅读框正确。并在影响LT毒性的关键氨基酸位点，用PCR方法引入点突变(丙氨酸→精氨酸)，成功构建了含有LTR72突变体基因的重组质粒pET—LTR72。     

猪细小病毒研究近况

猪细小病毒（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ，ＰＰＶ）是一自主型细小病毒（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ），它是引起畸胎的主要因素之一。通常，头胎怀孕母猪感染了ＰＰＶ之后，可引起繁殖障碍，主要症状为流产、不孕、产死胎、木乃伊胎等，给养猪业带来巨大经济损失。近３０年来的研究工作揭示了ＰＰＶ的各种特性，特别是８０年代以来，分子生物学和基因工程技术的运用，使我们能够从分子水平和基因水平去     

口蹄疫病毒3AB试剂盒的检测及比较

以重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB为检测抗原,研制了口蹄疫病毒非结构蛋白ELISA检测试剂盒,该试剂盒可用于判定被检动物是否感染口蹄疫病毒。重组口蹄疫病毒非结构蛋白3AB作为检测抗原包被酶标板反应孔,以辣根过氧化物酶标记的重组蛋白A/G作为第二抗体,建立了抗非结构蛋白抗体检测的方法。结果表明,在1 746份免疫猪血清中,3AB-ELISA对免疫猪血清的特异性为98.68%;在1 077份健康非免疫猪血清中,3AB-ELISA对健康非免疫猪血清的特异性为98.68%;在36份人工感染猪血清中,3AB-ELISA对阳性检出率为100%。而牛的特异性的各项指标和阳性检出率分别为94.04%,97.96%和100%。猪/牛口蹄疫病毒非结构蛋白酶联免疫吸附试验检测试剂盒与国外同类试剂盒比较,阳性检出率高出12.5个百分点。     

区分动物疫苗免疫与病毒感染的口蹄疫非结构蛋白3AB鉴别诊断试剂盒的研制

以口蹄疫非结构蛋白3AB作为抗原的ELISA，适用于鉴别诊断感染和注苗动物。以3ABC基因片段为模板，经RT-PCR扩增得到3AB基因片段，与pET32a连接后，转化宿主菌BL21（DE3）plysS，IPTG诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE和Westemblot结果表明，表达的重组3AB蛋白，分子量约为50Ku，ELISA结果显示，重组3AB蛋白可用于猪、牛口蹄疫病毒感染与疫苗免疫抗体的鉴别诊断。     

产肠毒素大肠杆菌肠毒素LTB、STI和STⅡ融合基因的构建与表达研究

PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,FTEC)LTB、STI、STⅡ基因，将LTB、STI、STⅡ基因重组入pET32a质粒载体，对构建的重组质粒pBST进行酶切分析、PCR检测以及核苷酸序列分析，结果表明，插入片段LTB－STⅡ－STI的核苷酸序列与预期一致，且阅读框正确。pBST在宿主菌BL21（DE3）RIL中的表达产物经SDS－PAGE初步分析，显示重组融合蛋白的分子量约为40kD，其表达量约占菌体总蛋白的46％。     

小鹅瘟病毒GPV-YG株主要开放性阅读框架核苷酸序列分析

通过PCR技术分段扩增小鹅瘟病毒(Goose parvovirus,GPV)扬州分离株GPV-YG的2个主要开放性阅读框架(open reading frame,ORF)基因,对扩增产物进行核苷酸序列测定,其结果在GenBank登录。将上述序列与登录的国外参考株GPV—B株作比较,GPV-YG主要ORF核苷酸序列与GPV—B的同源性为94％,显示二者亲缘关系密切。在此基础上,分别确定了GPV-YG编码结构蛋白和非结构蛋白的基因组序列,并推导出GPV-YG结构蛋白和非结构蛋白的相应的氨基酸序列,GPV-YG与GPV-B结构蛋白的氨基酸序列同源性为96．4％,非结构蛋白同源性为97．9％,由此进一步分析了GPV-YG结构蛋白和非结构蛋白的氨基酸序列与功能特征。同时,将GPV-YG主要ORF与番鸭细小病毒(Muscovy Duck Parvovirus,MDPV)-FM作比较,核苷酸序列同源性为80％,非结构蛋白推导氨基酸序列同源性为89．6％,结构蛋白为84．6％。     

“O”型口蹄疫病毒生物合成多肽苗保护性抗体的免疫应答

ｐＸＺ５００持粒表达的生物合成多肽苗分别以总剂量３２μｇ／头和０．３４６ｍｇ／头分两次免疫接种豚鼠和猪，均可获得保护性抗体的良好免疫应答。豚鼠和猪在第一次免疫接种后４０ｄ和４５ｄ时，其血清的乳鼠保护指数均在２．０以上；分别用５０个发病单位强毒攻击，均可获得１００％保护。