四种口蹄疫病毒非结构蛋白抗体ELISA试剂盒检测猪血清样本的质量评估

[目的]对4种口蹄疫病毒非结构蛋白抗体ELISA试剂盒进行质量评估。[方法]用4种商品化的口蹄疫非结构蛋白抗体ELISA检测试剂盒,对非免疫无疫、免疫健康、免疫感染和非免疫人工感染4种类型猪血清样本进行检测,分析试剂盒的诊断敏感性、诊断特异性、分析敏感性、分析特异性及重复性。[结果]4种试剂盒的诊断敏感性在76.8%~94.4%之间,诊断特异性在97.7%~100%之间,分析敏感性和分析特异性较好。4种检测试剂盒与4种猪常感染疾病的阳性血清不发生反应。试剂盒的批间重复性为(10.545±6.845)%~(37.577±28.626)%;批内重复性为(9.037±6.075)%~(37.601±27.027)%。[结论 ]在实际应用中,需根据检测目的不同,选取相应的试剂盒。     

用大肠杆菌表达FMDV NSP 3ABC鉴别感染与注苗动物ELISA方法的建立

用大肠杆菌表达的FMDV NSP 3ABC经纯化复性后作为抗原,建立了鉴别感染动物与注苗动物的间接ELISA方法.用该方法检测了大量的牛血清样品,确定了3ABC-I-ELISA判定标准.3ABC-I-ELISA以(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)来计算待测样品效价.当效价小于0.2为阴性,介于0.2～0.3之间为可疑,大于0.3为阳性.根据此判定标准所测试验感染动物血清都为阳性,敏感性达100%;97.06%疫苗注射动物血清为阴性;98.39%的非免疫健康牛(未感染也未注射疫苗牛)血清为阴性.研究证实感染牛在1年以后仍能检测到3ABC抗体.这说明3ABC-I-ELISA能够鉴别FMDV感染动物和注苗动物,可作为大面积疫情监测的方法应用.     

口蹄疫病毒非结构蛋白2C基因主要表位区的表达及活性检测

根据测定的口蹄疫病毒（FMDV）2C基因序列,设计了一对特异性的表达引物,用于扩增2C基因5′-端174bp和3′-端279 bp连接片段,该区含有较丰富的B细胞表位编码序列。扩增片段通过NcoⅠ和SalⅠ酶切位点插入表达载体pET-30a。序列测定表明,目的基因片段连接正确,按正确的读码框插入表达载体中。重组表达质粒转化BL21（DE3）pLys,经IPTG诱导表达目的蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western Blotting检测表明,2C基因主要表位区成功地在大肠杆菌表达,表达产物为约23 ku的融合蛋白,能够与FMDV感染动物血清发生特异性反应,而不与健康和灭活疫苗免疫动物血清反应。该研究为建立鉴别FMDV自然感染动物和灭活疫苗免疫动物的酶联免疫转印（EITB）方法提供了所需的材料。     

PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞后对Ⅲ型干扰素应答的调控

Ⅲ型干扰素(IFN-λ)是一种新发现的抗病毒因子,在天然免疫和获得性免疫应答方面具有多重功能;猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染后造成猪的免疫抑制状态,Ⅰ型和Ⅱ型干扰素的应答受到抑制,IFN-λ的应答情况还不清楚。为揭示PRRSV感染猪后IFN-λ的应答情况与调控机制,以期进一步揭示PRRSV抑制宿主抗病毒免疫应答的分子机理。利用PRRSV强毒与弱毒株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM),通过实时荧光定量PCR(real-time PCR)和Western blot检测IFN-λ在mRNA与蛋白水平的差异,并检测了不同非结构蛋白(NSP)对IFN-λ的调控作用。结果发现PRRSV感染PAM细胞后均在mRNA水平上诱导IFN-λ1和IFN-λ3表达上调,且IFN-λ3比IFN-λ1上调更明显;然而在蛋白水平上二者均为表达下调。人源IFN-λ3比IFN-λ1显示出更强的抑制PRRSV复制的作用,且对强毒株GSWW/15的抑制效果更明显。PRRSV NSP7b和NSP9转染PK-15细胞后能使IFN-λ3的mRNA上调表达,但蛋白水平无变化;而NSP7a对IFN-λ3的mRNA和蛋白水平均无影响,提示NSP7b和NSP9可能通过某种机制抑制IFN-λ3的应答。     

口蹄疫自然感染动物与免疫动物鉴别诊断研究进展

口蹄疫是偶蹄动物高度接触性传染病 ,能引起巨大经济损失。国际兽医局将其列为 A类动物传染病之首。除发达国家外 ,大多数发展中国家都采用注射疫苗的办法来控制该病的流行。因此如何区分感染动物和免疫动物是口蹄疫防制中迫切需要解决的问题。目前口蹄疫灭活疫苗的生产工艺可以将绝大部分的非结构蛋白除去 ,因而灭活疫苗免疫动物只能产生结构蛋白抗体 ,而感染动物能产生结构蛋白抗体 ,也能产生非结构蛋白抗体 ,因此 ,检测非结构蛋白抗体为鉴别口蹄疫感染动物与免疫动物提供了美好前景。文章从鉴别诊断的原理 ,非结构蛋白的免疫特性 ,鉴别诊断所面临的问题及解决方案 ,应用非结构蛋白作为鉴别诊断抗原的研究现状等方面进行了综述。     

国内现有猪口蹄疫O型灭活疫苗对2010年流行毒株的抵抗力

在2010年上半年,猪O型口蹄疫不断发生,作为国内几个生产厂家的猪口蹄疫现用疫苗种毒的提供者,我组进行了猪源流行毒对该种毒灭活疫苗免疫猪的攻毒保护试验及观察。结果如下:1)、猪源流行毒致猪发病速度慢。猪源流行毒接种猪后,致猪发病的时间在3～5天,而疫苗株致猪发病时间是接种后2～3天;2)、该疫苗毒株能有效抵抗猪源流行毒的攻击,PD50大于6;3)、免疫保护和ELISA抗体水平没有线性相关性;4)、免疫保护与140S抗原量有相关性。     

口蹄疫疫苗研究与防控实践

正口蹄疫是严重危害猪、牛、羊等偶蹄动物的烈性传染病,不仅会造成严重的经济损失,也是一种重要的政治经济病,发生口蹄疫的国家,动物及其产品的国际贸易受到很大限制,因此世界各国都非常重视对该病的防控。我国采用以免疫为主的综合性防控措施,而且随着口蹄疫疫苗技术的进步,取得了非常明显的防控成绩。口蹄疫疫苗主要以灭活疫苗为主,     

大肠埃希氏菌表达FMDV3AB非结构蛋白的纯化复性与活性检测

采用超声波裂解细菌，高浓度尿素裂解包涵体和金属螯合亲合层析的方法对大肠埃希氏菌中表达的FMDV3AB非结构蛋白进行纯化，经SDS—PAGE分析，3AB融合蛋白纯度达90％以上。采用稀释法和氧化型、还原型谷胱甘肽系统相结合方法对融合蛋白进行复性，通过Westernblotting分析，表明复性后的3AB融合蛋白能与抗FMDV抗体发生特异性结合。ELISA检测表明，复性后的3AB融合蛋白有很好的抗原活性。     

口蹄疫病毒非结构蛋白2C主要表位区的原核表达及其单克隆抗体的制备

本研究制备并鉴定了口蹄疫病毒非结构蛋白2C的单克隆抗体(mAb).以纯化的原核表达2C蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,所获得的杂交瘤细胞经间接ELISA法筛选,有限稀释法克隆,直至所克隆的细胞能够100%的分泌抗体,用Dot-ELISA以及IFA对mAbs的特异性等进行鉴定.共获得4株抗重组蛋白2C的mAbs,其亚类鉴定结果3株为IgG1,1株为IgG2b,叠加ELISA初步判定4株单抗所识别表位相同或相近.Dot-ELISA显示这些mAbs与重组2C蛋白和(2C3AB)蛋白以及口蹄疫病毒O/China99感染的BHK-21细胞中的2C抗原均可特异性结合,IFA结果显示所得单抗能与FMDV感染细胞中的2C蛋白特异性结合.本研究获得的针对2C蛋白的特异性mAb,为进一步研究2C蛋白的结构和功能以及诊断方法奠定了基础.     

口蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC在大肠杆菌中的高效表达

将牛源O型口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)China／99株非结构蛋白基因3ABC从pGEM-T-3ABC重组质粒中亚克隆到原核表达载体pTriEx-4Neo上,成功构建重组表达质粒pTriEx-3ABC。将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中表达,表达产物经SDS-PAGE可检测到分子量约为59．1ku的目的蛋白带,经薄层扫描分析,目的蛋白占菌体总蛋白的31．4％。Western blotting分析证明表达产物能被FMDv阳性血清所识别。表达产物纯化后作抗原进行ELISA检测,结果表明,表达的蛋白显示特异的免疫学活性,并能区分自然感染动物和注苗动物。研究为以FMDV非结构蛋白为抗原,建立自然感染动物和注苗动物的鉴别诊断方法提供了材料。