新疆边境地区蜱携带梨形虫种类的分子鉴定

为了调查新疆边境地区梨形虫在当地蜱中的携带情况,对采集于2019年4月份和5月份的新疆边境地区共25个县(市)的蜱进行形态学鉴定,提取DNA,利用梨形虫套式引物进行扩增并测序,并采用IQ-Tree软件的ML法构建不同地理株的进化关系.结果显示,采集到的1 516只蜱包括4个属9个种,分别为森林革蜱(Dermacento...     

牛泰勒虫的分离鉴定及进化分析

牛泰勒虫病是严重危害养牛业可持续发展的血液原虫病,本试验采用血涂片镜检和特异性PCR检测技术,对中国某种牛场的18份血样进行了泰勒虫检测,然后分别用ITS基因通用引物和4种MPSP等位基因特异性引物自阳性样品中扩增出对应的基因,克隆测序后,进行序列比对和进化分析,确定泰勒虫基因型。结果显示,自18份牛血样中检出3份阳性样品,且全为瑟氏泰勒虫感染;3个阳性样品的瑟氏泰勒虫MPSP等位基因扩增结果显示,1个阳性样品为I (Ikeda) 和C (Chitose)型的混合感染,另2个样品为I型单一感染,而均无B (Buffeli)和Thai型;用扩增的MPSP基因测序,构建进化树,确认其感染的瑟氏泰勒虫存在MPSP 1型和2型。这些结果表明,该种牛场存在瑟氏泰勒虫感染,且同时存在2种MPSP等位基因型;MPSP等位基因的复杂性可能使该病的免疫防控更加困难。本试验结果为深入研究瑟氏泰勒虫感染情况及免疫防控提供了数据支持,并为养防一体做好监控。     

环形泰勒虫3-磷酸甘油醛脱氢酶的原核表达、多克隆抗体制备及亚细胞定位

为了研究环形泰勒虫3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的功能,本试验利用PCR技术从环形泰勒虫裂殖体cDNA中扩增环形泰勒虫GAPDH (TaGAPDH)基因,将扩增产物克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行融合蛋白诱导表达,融合蛋白纯化后免疫家兔,制备多克隆抗体,分别用间接ELISA和Western blotting检测抗体的效价和特异性;利用激光共聚焦荧光显微镜观察TaGAPDH蛋白在环形泰勒虫裂殖体中的亚细胞定位.结果显示,克隆得到了TaGAPDH全长基因,大小为1 020 bp;SDS-PAGE分析结果显示,融合蛋白大小约44 ku,且以包涵体形式存在.制备的多克隆抗体效价高达1:12 800,具有很高的特异性;亚细胞定位显示TaGAPDH蛋白主要分布于环形泰勒虫裂殖体细胞质内.以上结果表明本试验成功克隆表达了TaGAPDH基因,并制备了针对TaGAPDH蛋白的兔多克隆抗体,为筛选环形泰勒虫病疫苗、药物靶点及研究环形泰勒虫能量代谢奠定了基础.     

鸡γ-干扰素基因的克隆及原核表达

参照Digby发表的鸡γ-干扰素的核苷酸序列，设计一对引物，应用RT—PCR技术，从ConA诱导过的鸡脾淋巴细胞中特异性地扩增出大小约为500bp的基因片段。将该扩增基因进行克隆测序，结果表明其序列与Digby报道的CHIFN-γ基因序列的同源性达100％。将该基因插入原核表达载体pGEX-4T-γ中构建成重组表达载体pGEX—CHIFN-γ，并将其导入大肠杆菌BL21中，诱导表达的重组蛋白经SDS—PAGE分析，分子量约为43ku，表明所克隆的CHIFN-γ基因在原核细胞中得到了表达。     

青海省四县牦牛牛病毒性腹泻的血清学分析

从采集的557份牦牛血清样品中,用分层抽样法选择青海省海北州祁连县和刚察县、海南州贵南县和大通县不同年龄和性别牦牛血清232份,用抗体检测试剂盒进行牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体测定分析流行率,并用RT-PCR扩增BVDV基因组5'-UTR,测序进行病毒基因亚型分析.结果表明,牦牛总体BVDV真实流行率为82.30％...     

基于靶向代谢组学研究环形泰勒虫对宿主细胞能量代谢的影响

环形泰勒虫感染宿主淋巴细胞可使其获得类似肿瘤细胞样的无限增殖能力，而细胞转化现象会伴随虫体的消失而终止，该寄生模式为人们更好地理解环形泰勒虫和细胞相互作用的分子机制提供了一个理想模型。本研究通过靶向代谢组学方法研究环形泰勒虫感染对宿主细胞能量代谢相关代谢物的变化情况，为进一步揭示其转化机制奠定基础。以环形泰勒虫转化细胞为试验材料，设置布帕伐醌（buparvaquone，BW720c）药物处理组、DMSO对照组及空白对照组，观察不同处理对环形泰勒虫感染细胞生长状态的影响；并在72 h时收集细胞样品，利用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）的靶向代谢组学方法对不同处理组的细胞样品进行能量代谢相关代谢物检测，再运用能量数据库对检测到的代谢物变量进行化合物种类鉴别，使用最小判别二乘分析法（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）筛选差异代谢物。通过对转化细胞的药物试验发现，相对于对照组，试验组在24 h内细胞增殖无明显变化，从36 h开始试验组的细胞生长速度明显低于对照组，在72 h时两组间的活细胞数量相差最大。PLS-DA分析发现，代谢物变量可将药物处理组及DMSO对照组之间聚类区分，并筛选到21种组间差异的代谢物，药物处理组中有8个代谢物上调，13个代谢物下调。经富集分析发现这些代谢物主要是与能量代谢相关的代谢物，如谷氨酰胺、L-乳酸、苹果酸、丙酮酸、异柠檬酸等。同时用相应的试剂盒检测后发现，谷氨酰胺、L-乳酸及丙酮酸的含量在药物处理组和对照组的变化趋势与靶向代谢组学检测的结果一致。本试验通过靶向代谢组学分析环形泰勒虫感染细胞的差异代谢物和代谢途径，说明环形泰勒虫感染可显著影响感染细胞的能量代谢，为进步阐明环形泰勒虫转化细胞的机制提供思路。     

1株牛病毒性腹泻病毒分离毒株的基因组特征

旨在从宁夏某奶牛群持续感染牛分离牛源牛病毒性腹泻病毒（BVDV）,并解析其基因组特征,为研究我国不同地区BVDV分离株遗传演化规律提供理论依据。利用BVDV抗原检测试剂盒检测宁夏回族自治区银川市某示范区的240头高产奶牛间隔两周的双份抗凝血,筛选持续感染牛,分离血液淋巴细胞制备裂解液接种牛肾细胞（MDBK）,分离鉴定获得BVDV株,克隆测序获得全基因组序列,比较分析其遗传演化关系。从该示范区高产奶牛筛选获得2头持续感染牛,分离获得1株非致细胞病变型BVDV,命名为NX2019/01。测序获得基因组全序列（12 107 nt）,其中ORF长11 703 nt,编码3 898个氨基酸。在基因组水平,NX2019/01株与我国SD-15、ZM-95、XC、LN-1等1m亚型分离株相似性较高（92.17%~93.84%）,但E^rns、E1以及E2基因存在较大差异。示范区同群牛急性感染BVDV时,毒株E2蛋白N端编码区核苷酸突变可导致第9位或第67位氨基酸变异。重组分析表明,NX2019/01株E2基因179—288位核苷酸区段以及ZM-95株E1基因168位—E2基因332位核苷酸区段存在相似的重组信号,可能由主要亲本SD-15株与次要亲本LN-1株重组形成,表明NX2019/01株、ZM-95株在演化进程中与SD-15株以及LN-1株或早期流行的高度相似毒株存在密切关联。本研究从持续感染高产奶牛分离获得了牛源BVDV-1m亚型毒株,在基因组水平厘清了BVDV-1m亚型毒株的进化关系,并首次发现同亚型BVDV毒株基因同源重组,为进一步研究BVDV在我国的演化规律奠定了基础。     

羊泰勒虫病血清学调查

应用酶联免疫吸附试验(ELISA)对我国部分省(区)的羊泰勒虫病进行了血清学调查,以便了解近年来我国羊泰勒虫病的流行现状.2004-2005年间,在我国部分省(区)总共采集到1 170份绵羊和山羊血清,并用间接ELISA检测抗羊泰勒虫抗体.结果显示,在5省13个县中除甘肃景泰县无羊泰勒虫病,其他地方均有羊泰勒虫病,且甘肃临洮感染率最高为93.8%,表明羊泰勒虫病在我国北方羊群中流行仍相当严重.此外,从2001年4月至2002年3月,从野外采集青海血蜱感染3只绵羊,收集1年的血清,采用ELISA方法,对羊泰勒虫血清抗体水平动态进行了评定,结果表明,实验室人工感染的抗羊泰勒虫抗体水平在感染后40 d最高,按此结果推算,在野外蜱的出现时间是4月份,收集血清应在5月中旬.     

盾糙璃眼蜱传播的牛泰勒虫分离鉴定及生物学特性

自新疆伊宁地区黄牛体表采集的盾糙璃眼蜱饥饿或半饱血成虫,带回实验室感染除脾牛.经血涂片检查发现,于感染后第21天,病牛血液中出现一种以圆环形与卵圆形为主的泰勒虫.经形态学观察和18 S rRNA基因测序和进化关系分析证明,它们为环形泰勒虫.将此饱血成蜱经实验室饲喂条件下,孵化出的幼虫分别饲喂于牛与家兔两种不同的动物,结果在饱血若虫阶段所有的蜱均从两种动物体表脱落,不再叮咬,饥饿成蜱又更换另一宿主,证明其是二宿主蜱.