某羊场和田羊与策勒黑羊无浆体季节性感染PCR检测

为了解和田羊和策勒黑羊无浆体季节动态感染情况,分别于2015年冬至、2016年春分、夏至和秋分,在策勒县某牧业合作社采集和田羊和策勒黑羊血液样本共120份,应用PCR对无浆体的MSP4基因和16SrRNA基因进行扩增。结果发现,检测绵羊的无浆体总阳性率为99.2%(119/120),以绵羊无浆体(Anaplasma ovis)和嗜吞噬无浆体(A.phagocytophilum)混合感染为主,占阳性样本比例为61.3%(73/119),A.ovis和A.phagocytophilum占阳性样本比例分别为31.1%(37/119)和7.6%(9/119)。在不同季节,和田羊和策勒黑羊无浆体均普遍感染,差异不显著(P>0.05)。结果显示,新疆策勒县某羊场绵羊的无浆体病全年均可流行,应引起人们重视。     

一株白僵菌的分离鉴定及其对微小牛蜱的致病力试验

为了得到用于防控微小牛蜱的高毒力菌株,本试验从野外微小牛蜱饱血雌蜱体表分离出一株白僵菌,通过形态学和分子生物学方法进行了鉴定,确认该分离株为球孢白僵菌.致病力研究表明,当孢子浓度达到108孢子/mL,该菌株对微小牛蜱饱血成蜱的致死率即可达到100%,为微小牛蜱的生物防控试剂的研究及应用奠定了基础.     

伽氏疏螺旋体尚志株P66基因的原核表达与鉴定

为获得伽氏疏螺旋体尚志株（B. garinii SZ）的P66蛋白,本研究从培养的螺旋体菌液中提取总RNA,反转录合成第一链cDNA,利用PCR扩增P66基因。将目的片段连接表达载体pET-30a（+）,并转化大肠杆菌表达菌BL21（DE3）,经PCR、双酶切及测序验证正确后,进行IPTG诱导表达和纯化,然后将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。SDS-PAGE结果显示,获得约70 ku的表达产物;Western blotting分析表明,表达产物与抗His标签的小鼠单克隆抗体、螺旋体鼠源阳性血清、兔抗P66多克隆抗体均能发生反应,获得的多克隆抗体也可识别天然蛋白。本试验成功表达了B. garinii SZ株P66蛋白,并制备了多克隆抗体,为后续B. garinii SZ株P66蛋白的功能研究奠定了基础。     

一种用于非洲猪瘟病毒检测的PCR方法

基于非洲猪瘟病毒(ASFV)VP72基因设计引物,建立一种检测非洲猪瘟病毒的PCR方法。应用本研究所建立的方法与OIE参考的方法进行比较,并对参考实验室提供的非洲猪瘟病毒17个分离株的基因组以及本实验室收集的野外样品进行检测。结果显示:本研究设计的引物具有良好的特异性,与猪的其他病原没有交叉反应;其敏感性与OIE参考的方法相当;所建立的PCR方法能够成功扩增非洲猪瘟病毒17个分离株的基因组,野外样品检测均为阴性。根据上述研究结果,本研究所建立的方法具有很好的应用性,能够用于非洲猪瘟疫病的诊断以及防控。     

蓝舌病病毒NS1蛋白的截短表达、纯化及其多克隆抗体制备

本研究通过对蓝舌病病毒1型(BTV1)的NS1基因进行抗原性分析,选取其中抗原指数较高的片段(1～960 bp),利用RT-PCR扩增获得NS1截短基因序列,插入原核表达载体pET-30a中构建重组表达质粒pET-NS1-320aa,将该重组质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达并进行可溶性分析,利用S...     

中国部分地区羊泰勒虫病的流行病学调查及分类鉴定

【目的】调查近年来中国羊泰勒虫病的流行现状,并对其分离株进行分子分类学鉴定。【方法】对分离自2005-2011年间的羊血液基因组以及蜱基因组,依次用吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和绵羊泰勒虫特异引物进行PCR扩增。对阳性样品进行18S rRNA基因的特异扩增和测序分析,并建立系统发育树。【结果】对所有羊血液基因组和蜱基因组的PCR扩增表明,在中国所调查的4省9县市,羊泰勒虫病的流行存在明显差异。甘肃省羊泰勒虫病的发病率和感染率较高,主要呈吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫混合感染,现场调查危害比较严重。新疆喀什仅存在绵羊泰勒虫,调查没有见到临床发病病例。在湖北样品中检测到吕氏泰勒虫,但未发现临床上发病病例。在云南样品中没有检测到羊泰勒虫及其发病病例。【结论】羊泰勒虫病在中国上述区域呈现不同程度的发病率和感染率,该研究为这些区域羊泰勒虫病的综合防治提供了参考依据。     

微小牛蜱4D8基因原核表达及免疫原性分析

按GenBank已知微小牛蜱的4D8基因核苷酸序列设计1对表达引物。提取微小牛蜱幼蜱总RNA,反转录合成双链cDNA,用设计的表达引物扩增出4D8基因,扩增得到的核苷酸长486 bp,编码161个氨基酸,该蛋白预计分子质量为18 ku。将该基因亚克隆到原核表达载体pGEX4T-1,构建重组原核表达载体pGEX4T-1-4D8,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,可成功表达。重组融合蛋白分子质量为45 ku左右,与预期大小一致。Western blot显示,兔抗微小牛蜱唾液腺、肠道和卵巢抗体能够识别重组表达蛋白。     

甘肃省景泰县羊无浆体病的诊断

为建立羊无浆体病简便快捷的病原学检测方法,论文以马米玲等已建立的边缘无浆体MSP5重组抗原间接ELISA检测方法对甘肃省景泰县多地采集的219份田间样品进行羊无浆体ELISA检测,以PCR检测方法进行病原学的检测和验证。同时为进一步验证MSP5基因在边缘无浆体和羊无浆体之间的保守性,Western blot检测证实边缘无浆体重组蛋白在45ku处与羊无浆体阳性血清反应,与羊其他病原阳性血清均不反应,表明该重组蛋白适合作为羊无浆体病的诊断抗原。在被检的219份样品中,ELISA方法检测阳性率为34.7%(76/219),PCR方法阳性率为30.6%(67/219),证实该地区存在羊无浆体病,与以往调查结果相比,阳性率有所下降。利用边缘无浆体MSP5重组抗原建立的EILSA方法具有良好的特异性和敏感性,可以检测羊无浆体病,为羊无浆体病的血清学诊断及流行病学调查提供了手段。     

犊牛粪便中益生菌的分离与鉴定

为了筛选出能够抑制犊牛腹泻的益生菌株,本研究采集了20份健康犊牛新鲜粪便,采用厌氧培养、形态学观察以及分子鉴定技术,初步分离得到3株革兰氏阳性杆菌(A1、A2和A3)和4株革兰氏阳性球菌(B1、B2、B3和B4),并对这些菌株进行分子鉴定。鉴定结果表明:A1和A2均为罗伊乳杆菌,A3为黏膜乳杆菌;B1为坚强肠球菌,B2为海氏肠球菌,B3和B4均为屎肠球菌。本研究为防治犊牛腹泻提供了更多的候选菌种。     

甘肃、青海和宁夏地区牛病毒性腹泻病毒Erns基因的变异分析

分析2013—2019年中国西北部分省区不同基因亚型牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗原基因E^rns的分子特征,了解其遗传演化规律。从甘肃、青海、宁夏规模化牛场送检的疑似牛病毒性腹泻发病牛150份EDTA抗凝血提取总RNA,利用RT-PCR扩增病毒基因组E^rns-E1区,克隆测序后比对,构建系统进化树进行遗传演化关系分析。利用牛肾细胞MDBK对检出的不同基因亚型BVDV进行分离,并鉴定其生物型。RT-PCR扩增结果表明,BVDV总体阳性率为37.33%,其中甘肃省、青海省、宁夏回族自治区BVDV阳性率分别为37.68%、35.71%、40.00%。获得56份E^rns-E1 DNA,克隆测序获得33条不同的E^rns序列,长度均为681 bp,分析表明流行株分属10个BVDV基因亚型：BVDV-1a （2株）、BVDV-1b （5株）、BVDV-1c （1株）、BVDV-1d （3株）、BVDV-1m （11株）、BVDV-1o （1株）、BVDV-1p （4株）、BVDV-1q （4株）、BVDV-1v （1株）、BVDV-2a （1株）。分离获得BVDV-1a亚型、BVDV-1b亚型、BVDV-1v亚型、BVDV-2a亚型分离株各1株,BVDV-1 d亚型分离株2株,均为非致细胞病变型。各亚型株间E^rns基因核苷酸相似性以BVDV-1a～1d经典亚型株（79.8%～85.9%）或1m～1q及1v新亚型株（81.0%～87.3%）较高,以BVDV-1 m和BVDV-1p流行株亚型间相似性最高（87.3%）。各亚型株E^rns基因编码蛋白的RNA酶活性位点以及双链RNA作用基序（₁₃₉KKGK₁₄₂）保守,但E^rns第26位糖基化位点（26 NRSL）在1m～1q、1v亚型株移位（24 NVSR）。首次以E^rns核苷酸序列构建系统进化树,结果显示1m～1q及1v等亚型BVDV株在进化上关系较为密切。本研究首次选用E^rns靶标基因对甘肃、青海、宁夏部分省区牛源BVDV株进行同源性及系统进化分析,发现10个基因亚型流行株,以1m亚型株最为普遍,1m～1q及1v等亚型株亲缘关系密切。