新型动物疫苗研究进展

动物疫苗产业是战略化产业,新型疫苗将成为其重要组成部分.论文对标记疫苗、活载体疫苗等新型疫苗的优缺点进行了比较,列举了相应的市场化产品,并对新型疫苗的发展方向进行了展望.     

应用双重PCR方法对奶牛乳腺炎金葡菌溶血毒素进行分型

溶血毒素是一种胞外毒素,是金葡菌主要毒力因子之一.金葡菌人源菌株多数产α-溶血素,而从动物分离的菌株多产β-溶血素,但是引起奶牛乳腺炎的金葡菌中α、β型未见相关报道.试验根据GenBank公布的α和β溶血素序列,设计双重PCR引物,对在山东省内20多个规模化奶牛场乳腺炎病例中分离得到的金葡菌提取模板,检测奶牛乳腺炎金葡菌溶血素基因型,为研制奶牛乳腺炎金葡菌基因工程疫苗提供科学的依据.试验建立了双重PCR快速检测金葡菌溶血毒素分型的方法,此法特异性好,准确性高,检测快速,证实应用此法对奶牛乳腺炎金葡菌溶血毒素进行分型是可行的.     

金黄色葡萄球菌荚膜多糖的提取及其多糖含量的测定

本实验目的在于提取纯化金黄色葡萄球菌荚膜多糖,并测定多糖含量。采用超声波破碎的菌液,用CTAB结合其中的多糖,CaCl2解离,乙醇沉淀等化学方法提取纯化金葡菌荚膜多糖,利用苯酚-硫酸法测定其含量。结果显示,得到荚膜多糖0.31g,含量为65.06%。结果表明,成功提取金葡菌荚膜多糖,并对其含量进行了测定,初步确定了粗提金葡菌荚膜多糖的方法。     

犬瘟热病毒野毒株H蛋白基因的序列分析

对引起长春某犬场犬死亡的犬瘟热病毒（ Ｃ Ｄ Ｖ）野毒株（ Ｌ Ｉ Ｕ）附着或血凝蛋白（ Ｈ）基因进行了全基因序列测定,并与疫苗弱毒 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株作了比较。用 ４ 对引物对 Ｌ Ｉ Ｕ 株进行了 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增,将扩增得到的 ４ 个阳性 Ｐ Ｃ Ｒ 片段纯化后直接测序。将所测序列拼接后,去掉侧翼的 Ｆ 基因和 Ｌ 基因序列,得到了 Ｈ蛋白的全基因序列。该基因全长为 １ ９４６ ｂｐ,开放阅读框架（ Ｏ Ｒ Ｆ）始于 ２１～２３ 位的 Ａ Ｔ Ｇ,终止于 １ ８４２～１ ８４４位的 Ｔ Ｇ Ａ,编码 ６０７ 个氨基酸。将 Ｌ Ｉ Ｕ 毒株与疫苗弱毒 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株进行比较,二者 Ｈ 基因核苷酸序列的同源性为 ９１．７％ ,推导的 Ｈ 蛋白氨基酸序列的同源性为 ９０．２％ 。 Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ 株的 Ｈ 蛋白潜在的 Ｎ 联糖基化位点为 ４ 个,而 Ｌ Ｉ Ｕ 株 Ｈ 蛋白为 ８ 个。糖基化位点的不同可能对 Ｌ Ｉ Ｕ 株 Ｈ 蛋白的抗原性产生影响。２ 个毒株 Ｈ 蛋白的半胱氨酸残基数目均为 １２ 个,且位置是保守的;疏水性有一定的不同,但推测的穿膜区位置是相同的,位于 ３５～５５ 位氨基酸之间。     

犬瘟热病毒小熊猫株附着蛋白基因的序列分析

为了从基因水平上研究我们分离的犬瘟热病毒（ＣＤＶ）小熊猫（ＬＰ）毒株与疫苗弱毒Ｏｎｄｅｒｓｔｅｐｏｏｒｔ株的差别,本文对ＬＰ毒株附着蛋白（Ｈ）基因进行了序列测定,我们设计了４对引物,对ＬＰ株进行了ＲＴ－ＰＣＲ扩增,将扩增得到的４个阳性ＰＣＲ片段纯化后,直接进行测序,把所测序列拼接后,去掉侧翼的Ｆ基因和Ｌ基因序列,得到Ｈ蛋白的全基因序列,该基因全长为１９４６ｂｐ,开放阅读框架（ＯＲＦ）始于２１－２３     

Asia1型口蹄疫病毒P1基因的原核表达及其抗血清的制备

[目的]研究Asial型口蹄疫病毒P1基因原核表达及其抗血清的制备。[方法]利用基因克隆技术获得Asia1型口蹄疫病毒（FMDV）的P1基因,然后将P1基因重组到pET-32a（＋）质粒中;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导及蛋白纯化后,进行SDS-PAGE;将重组菌BL21培养物用超声波裂解,对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备P1蛋白抗血清。[结果]获得了重组性阳性克隆;SDS-PAGE结果表明在105kD处出现了目的条带;Western-blot分析表明,抗血清可与原核表达的P1蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶5120。[结论]该研究结果为建立FMDV的血清学诊断方法及其基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

口蹄疫O型、A型和AsiaⅠ型病毒RT-PCR分型方法的建立

该研究旨在建立一种快速、灵敏及准确的口蹄疫病毒(FMDV)鉴定与分型的RT-PCR检测技术平台,为临床中有效准确地检测口蹄疫病毒提供有力的支持。根据NCBI中公布的FMDV序列(GenBank:JF749861.1),设计FMDV通用检测引物FP1/FP2;根据NCBI中公布的FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型序列,经过序列分析比对后,分别设计FMDV分型引物FO1/FO2、FA1/FA2和FAS1/FAS2。提取FMDVRNA后,利用随机引物扩增得到FMDV全cDNA,利用设计的引物进行PCR扩增及PCR反应条件的优化。结果表明:该研究建立的RT-PCR检测方法具有很好的特异性、敏感性和可重复性。成功建立了FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型检测及分型方法,为口蹄疫疾病的临床检测、流行病学相关调查及针对性的疫苗的制备奠定基础     

Asia1型口蹄疫病毒P1基因的原核表达及其抗血清的制备

[目的]研究Asial型口蹄疫病毒P1基因原核表达及其抗血清的制备。[方法]利用基因克隆技术获得Asia1型口蹄疫病毒（FM-DV）的P1基因,然后将P1基因重组到pET-32a（＋）质粒中;转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经IPTG诱导及蛋白纯化后,进行SDS-PAGE分析;将重组菌BL21培养物用超声波裂解,对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备P1蛋白抗血清。[结果]获得了重组性阳性克隆;SDS-PAGE结果表明在105 kD处出现了目的条带;Western-blot分析表明,抗血清可与原核表达的P1蛋白特异性结合,ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶5 120,[结论]为建立FMDV的血清学诊断方法及其基因工程疫苗的研究奠定了基础。     

牛A组轮状病毒VP4全基因的克隆与原核表达

以G6型牛轮状病毒总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增牛轮状病毒VP4开放性阅读框,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pEASy-T3载体中,成功构建出克隆质粒pEASY-T3-VP4.经双酶切后再将该基因重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建出原核表达质粒pET32a-VP4.将pET32a-VP4转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约108 KD的融合蛋白带,成功构建了能够稳定表达VP4蛋白的基因工程菌株,为进一步研制牛轮状病毒基因工程疫苗奠定了基础.