猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NS1基因的克隆及序列分析

猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV)SY-99株由本室分离，提取SY－99株的基因组DNA，利用PCR扩增出全长NS1基因，将该基因克隆到 核表达载体pET28a中并测序。结果表明，NS1基因全长1989bp，编码662个氨基酸，氨基酸序列中含有PP 制过程中发挥重要作用的保守基序GKRN，并有3个潜在的糖基化位点，分别位于356－359、446－449、513－516位氨基酸处，SY－99株NS1基因与其它PPV毒株NADL2－1、NADL2－2、Kresse株核苷酸同源性分别为98％、99％、99％，氨基酸同源性分别为97％、99％、995。SN1基因的克隆为研究NS1在PPV的复制中所发挥的功能及利用人工表达的NS1来制备诊断抗原提供了可能。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因表达质粒免疫小鼠的试验研究

基因疫苗是近几年来发展起来的一种新型疫苗，具有使用安全，生产、运输、贮存方便，免疫效果稳定持久的特点。实验采用PCR方法将从洛阳种牛场西门塔尔牛精液中分离的牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhino—traeheitis virus，IBRV)洛精株gD基因进行了扩增，经序列测定确证后构建了gD基因的真核表达质粒。将其单独或连同脂质体肌肉注射于BALB／c小鼠，应用ELISA定期检测血清抗体水平。结果表明，含IBRV gD基因的表达质粒能够引起小鼠的特异性血清抗体反应。     

适应无血清培养的HEK293细胞系的培育

为培育适合腺病毒增殖的无血清培养细胞系,本研究采用培养液渐进替换的方法获得了一株适应无血清培养的HEK293细胞(293SF),经检测293SF细胞具有稳定的支持腺病毒增殖与表达外源蛋白的能力;平均病变时间为97 h,比HEK293细胞缩短12.9%;毒价达到107.48TCID50/mL,比HEK293细胞提高43.3%;并且稳定性良好,连续传16代后293SF细胞状态与易感性未发生变化。该细胞系为腺病毒的无血清培养奠定基础。     

猪瘟病毒E2蛋白与猪RACK1相互作用的鉴定

为筛选和鉴定与猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白相互作用的猪宿主蛋白,我们采用酵母双杂交方法筛选猪肺泡巨噬细胞表达文库得到与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞RACK1蛋白,经共转化试验和GST pull-down试验进一步证实两者可以特异性结合,并且共聚焦试验表明两者共定位于细胞的细胞浆。本研究显示E2蛋白与宿主细胞RACK1蛋白存在相互作用,RACK1在CSFV感染过程中所发挥的功能有待进一步研究。     

马流感病毒血凝素基因甲病毒复制子重组表达质粒的构建及其免疫效力评价

为评价马流感病毒(EIV)HA基因核酸免疫效果,本研究以甲病毒复制子载体pSFV1CS分别构建了表达EIV H3N8亚型的美洲型和欧洲型HA基因的重组真核表达质粒。并将其转染293T细胞,经间接免疫荧光鉴定表明HA基因获得表达;以重组质粒免疫的BALB/c鼠能够检测到特异性抗体产生,而且HI抗体水平持续升高,同时小鼠体内IFN-γ、IL-4分泌水平也有所升高。攻毒后小鼠表现轻度临床症状,但病毒分离和RT-PCR均未检测到病毒。上述结果表明,该重组质粒pSFV1CS-EIV-HA具有良好的免疫原性并且可以诱导免疫动物产生较高免疫应答的能力。     

科学免疫距离我们有多远?

免疫是猪场一项重要的日常工作,是保证猪场正常生产的有力措施,所以免疫对养猪人来说都非常熟悉。但就是这个非常普通的工作环节,却一直存在很多问题 。 猪病种类多,感染途径复杂,所以很多猪场使用疫苗十几种,小猪一出生就要各种疫苗的“辅佐”,并且跟随其一生,疫苗能有效地防止疫病发生,但是增加的应激也着实不少;因此产生一个极端反向观点,认为猪病太多了,我也不知道到底应该打哪些苗,如果都打,不但投资大,而且可能产生副作用,所以什么苗也不打;另外一部分猪场比较重视防疫,请兽医制订免疫程序,这其中有饲养管理各个方面措施到位的,生产平…     

猪外周血单个核细胞cDNA酵母表达文库的构建及与猪瘟病毒E2蛋白相互作用细胞蛋白的筛选

为研究猪瘟病-毒(CSFV)蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用,本研究通过SMART技术合成猪外周血单个核细胞(PBMC)双链cDNA,以携带与载体pGADT7-Rec重组位点同源序列的特异引物经long-distance PCR扩增双链cDNA.纯化双链cDNA并与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌株Y187,经同源重组构建PBMC cDNA酵母表达文库.以CSFV E2蛋白为诱饵进行酵母双杂交筛选,得到阳性克隆根据序列比对分析结果,进一步进行共转化验证.结果显示筛选到17个与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,基因注释(GO)分析表明这些蛋白分别参与免疫、代谢、细胞生长与增殖、生物调节等过程,为研究它们与CSFV E2的相互作用奠定了基础.     

野猪粪便中乳酸菌的分离鉴定及特性研究

【目的】筛选安全的、具有优良特性的乳酸菌菌株,进一步研发益生制剂,为饲料添加剂等动物相关产品提供资源。【方法】从我国黑龙江省大兴安岭地区采集野猪粪便样品13份,编号后置于4℃保温箱迅速运回实验室,利用MRS培养基分离纯化乳酸菌。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株的基因组DNA,利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR鉴定,将扩增得到的序列测序后在NCBI上使用BLAST与GenBank数据库中序列进行对比分析,确定各菌株的分类学地位。将鉴定后的乳酸菌菌株分别接种于酸性（pH 3.0）和含胆盐（0.3%）的MRS培养基,在不同条件下评价乳酸菌菌株的耐酸、耐胆盐特性。将过夜培养的乳酸菌于室温条件下静置,在不同时间测定其OD_600nm,进行自凝集能力评价;过夜培养的菌株分别与致病性埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌3种致病菌混合后于室温静置,进行共凝集能力检测。在体外,分别进行乳酸菌菌株对Caco-2细胞和IPEC-J2细胞的黏附能力测定,评价不同菌株的黏附能力。通过测定乳酸菌菌株对致病性埃希氏大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌3种致病菌的抑菌环直径,评价分离菌株的抑菌活性。通过体内外试验评价乳酸菌菌株的安全性。在体外,分别以模式菌株嗜酸乳杆菌和金黄色葡萄球菌作为阴性对照和阳性对照,将3株乳酸菌菌株和对照菌株在血平板上划线,37℃厌氧孵育18—24 h,观察细菌菌落周围是否形成溶菌环,评价分离菌株的溶血特性。使用文献中已报道的毒力因子引物对分离的乳酸菌菌株进行PCR扩增,检测是否存在毒力因子的编码基因,评估分离菌株的安全性。在体内,将过夜培养的乳酸菌连续饲喂7周龄的BALB/c小鼠21 d,分别测定小鼠的初始体重和最终体重,观察计算体重变化情况;饲喂21 d后,解剖获取小鼠的脾脏、肝脏和肾脏计算器官指数,评价分离乳酸菌菌株的体内安全性。【结果】从野猪粪便中分离得到3株对酸和胆盐具备一定耐受力的乳酸菌,经鉴定分别为蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii）、耐久肠球菌（Enterococcus durans）和黏膜乳杆菌（Lactobacillus mucosae）。3株乳酸菌菌株均表现出较强的自凝集能力和对致病菌的共凝集能力,同时对Caco-2细胞和IPEC-J2细胞均表现出较强的黏附能力,抑菌试验结果显示黏膜乳杆菌对3种致病菌均具备较强的抑菌活性。经体内外安全性评价,3株乳酸菌菌株无溶血性,且均未检测到毒力基因,经其连续饲喂的小鼠行为表现正常、状态良好,其中,与对照组相比,黏膜乳杆菌饲喂后小鼠增重显著。【结论】从大兴安岭野猪粪便中分离的3株乳酸菌（特别是黏膜乳杆菌）具有良好的特性和安全性,具备进一步开发益生菌制剂的潜力。     

USP18分子通过Ⅰ型干扰素通路影响猪瘟病毒复制的研究

猪瘟病毒(CSFV)感染无特定病原(SPF)猪后,分离猪外周血单个核细胞进行转录组分析,数据显示病毒感染后泛素特异性蛋白酶18(USP18)基因的转录水平明显上升。为研究USP18分子对CSFV复制的影响及其作用机制,本研究通过构建过表达USP18的细胞系及应用特异性小干扰RNA下调表达USP18的方法,采用荧光定量PCR验证USP18对CSFV增殖的影响,结果显示USP18分子能够促进CSFV的复制;通过检测IFN-β、NF-κB及ISRE的启动子活性及I型干扰素(IFN-I)信号通路的下游分子m RNA的转录水平,采用荧光定量PCR和双荧光酶报答试验分析USP18对IFN-I信号通路的影响,结果显示USP18分子抑制IFN-I信号通路。以上结果表明CSFV通过诱导USP18分子的上调表达,抑制了IFN-I途径,从而逃避天然免疫防御,进而促进自身的复制。本研究为明确CSFV与宿主之间的相互作用及CSFV致病机制提供参考依据和奠定基础。     

非洲猪瘟:挑战与对策

正一、非洲猪瘟-养猪业的头号杀手1.非洲猪瘟。属于烈性传染病,死亡率可高达100%,OIE法定报告动物疫病,无商品化疫苗,依赖检测+扑杀的措施来防控,对政治、经济和社会造成重大影响。2.独特的非洲猪瘟病毒。非洲猪瘟病毒具有庞大而复杂的基因组,超强的体外生存能力,独特的宿主和生态循环,并且传染源和传播途径非常复杂。