《分子诊断学》课程教学探讨

正分子诊断学是以分子生物学理论为基础,利用分子生物学的技术和方法,研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化,为疾病的预防、诊断、治疗和判断预后提供信息和决策依据~([1])。分子诊断学对疾病的诊断、预防和治疗正发挥着日益重要的作用,已成为推动检验医学发展的主要力量,是21世纪检验医学的主题~([2])。如何发挥分子诊断学在检验医学中的优势,是检验医学工作者面临的     

重组弓形虫致密颗粒蛋白7的表达及免疫活性分析

目的:重组表达弓形虫致密颗粒蛋白7(GRA7),分析其免疫活性。方法:采用聚合酶链反应(PCR)从刚地弓形虫基因组DNA中扩增GRA7基因,经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23a(+),转化大肠埃希菌BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GRA7,用His-bindTM亲和层析柱纯化,免疫印迹和小鼠免疫分析其抗原性。结果:PCR扩增出大小约660bp的GRA7基因片段,并被亚克隆到原核表达载体pET-23a(+),构建了原核重组表达质粒pET-GRA7;表达纯化获得分子量约29,000的重组GRA7;重组GRA7能被弓形虫感染兔血清所识别,并诱导小鼠产生抗体滴度达1:12800。结论:获得了具有良好免疫学活性的重组抗原GRA7。     

钉螺肝脏蛋蛋白质双向电泳方法的建立

目的建立针对钉螺肝脏蛋白质组阵列分离的双向电泳方法。方法分析裂解液、细胞破碎、沉淀方法对钉螺肝脏蛋白质提取的影响,并优化双向电泳参数,建立钉螺肝脏蛋白质的提取方法和双向电泳条件。结果LysisⅢ（8mol/L尿素,4%CHAPS,65 mmol/L DTT,40 mmol/L Tris,0.5%IPG Buffer）提取钉螺肝脏总蛋白,2-D Clean-up试剂盒处理纯化总蛋白,等电聚焦参数为8000 v,50000 vh,成功获得了分辨率高、重复性好的双向电泳图谱,凝胶经EMBL银染,可分辨蛋白质斑点数约430个。结论建立了钉螺肝脏蛋白质双向电泳技术,为开展钉螺蛋白质组学研究奠定了良好基础。     

噬菌体表达短肽模拟日本血吸虫肝门型童虫表膜抗原表位的研究

目的　从噬菌体随机 12肽库免疫筛选日本血吸虫肝门型童虫表膜抗原 (SjHmAg)的模拟短肽分子 ,探讨其抗日本血吸虫的免疫保护效果。方法　以纯化的SjHmAg免疫血清IgG为配基免疫筛选噬菌体 12肽库 ,按吸附 洗脱 扩增的淘洗过程进行 3轮筛选 ;随机挑取噬菌体克隆用ELISA检测其特异性 ,并测序 ;用混和噬菌体克隆皮下免疫小鼠 3次 ,分别在 0、2、4周进行 ,第 6周每鼠经腹部感染 4 0± 1条日本血吸虫尾蚴 ,4 2d后剖杀冲虫 ,观察减虫及减卵效果。结果　经 3轮筛选 ,特异性噬菌体得到有效的富集 ,产出率为第一轮的 2 10倍 ;随机挑取 2 4个噬菌体克隆经ELISA鉴定 ,有 2 1个克隆能与SjHmAg免疫血清特异性反应 ;自动测序仪测序 ,结果发现它们的外源肽具核心序列 (STRKD) ;与对照组相比 ,混和噬菌体克隆免疫小鼠的减虫率为 16 .2 % ,减卵率为 5 9.0 %。结论　利用噬菌体展示技术可获得模拟SjHmAg短肽 ,这些短肽分子能诱导部分抗日本血吸虫保护力。     

SARS冠状病毒S蛋白部分序列1的克隆与表达

目的　构建SARS冠状病毒S蛋白部分序列 1(S1)的原核重组表达质粒 ,并分析其在大肠杆菌中的表达状况。方法　采用逆转录 -多聚酶链反应 (RT -PCR)技术从SARS冠状病毒RNA中扩增出编码S1蛋白的基因片段 ,并克隆至pMD18-T载体上 ;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序列分析 ;将阳性克隆的插入片段亚克隆至表达载体pGEX - 4T - 2 ,转化大肠杆菌JM10 9,PCR和双酶切鉴定转化菌落 ;将阳性菌株经IPTG诱导 ,SDS -PAGE和免疫印迹分析截短型S蛋白的表达。结果　RTPCR扩增出S1蛋白的特异片段 ,其阳性克隆的序列存在 2处碱基突变第 36位G变为A ;第 333位由C变为T) ,其中第 36位为有义突变 ,第 333位为同义突变 ;阳性克隆中截短型S1蛋白的基因片段被亚克隆到表达载体pGEX - 4T - 2而构建成重组表达质粒 ,并在JM 10 9中表达了S1蛋白的融合蛋白 ,表达的蛋白能与GST免疫血清和SARS病人血清反应。结论　成功构建了SARS冠状病毒S1蛋白的重组表达质粒 ,该质粒在大肠杆菌中表达了截短型S蛋白的融合蛋白。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA8截短型片段在原核中的表达

目的 构建弓形虫GRA8原核重组表达质粒，分析其表达状况。 方法 采用PCR技术扩增GRA8及其截短型片段的基因序列，经克隆后，亚克隆至原核表达载体中，构建GRA8及其截短型片段的重组表达质粒，分析GRA8的表达；将各重组菌进行诱导，将裂解上清用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化目的蛋白，免疫印迹法(Western blotting)分析纯化蛋白的活性。 结果 GRA8基因被正确插入原核表达质粒中，原核重组表达质粒在大肠埃希菌JM109中表达GRA8的水平低，几乎无完整GRA8的表达，截短型GRA8经谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法和SDS-PAGE获得纯化。纯化的截短型GRA8能被弓形虫感染兔血清识别。 结论 GRA8的原核重组表达质粒表达GRA8的水平低，纯化的截短型GRA8具一定的抗原反应性。     

日本血吸虫成虫肠道内容物中金属蛋白酶的鉴定

目的　鉴定日本血吸虫成虫肠道内容物中的金属蛋白酶。　方法　以明胶作底物 ,利用明胶 SDS PAGE分离日本血吸虫成虫肠道内容物 ,将电泳后的凝胶于不同 pH缓冲液和酶抑制剂中进行孵育 ,对其中的金属蛋白酶进行分析和鉴定。　结果　日本血吸虫成虫肠道内容物中存在降解明胶的金属蛋白酶 ,其最适 pH值为 7～ 9。金属蛋白酶抑制剂EDTA抑制其活性。电泳分离获得有活性的酶蛋白 ,该酶是血吸虫感染血清识别的弱抗原。　结论　日本血吸虫成虫肠道内容物存在金属蛋白酶     

Cystatin-ELISA法诊断日本血吸虫病的研究

目的 建立一种敏感、高特异性的血吸虫病诊断方法。方法 应用Cystatin捕获血吸虫吐出物中的半胱氨酸蛋白酶，再进行ELISA试验检测日本血吸虫（Sj)病人血清中相应的特异抗体。结果 检测120例慢性血吸虫病人血清，84例非疫区正常人血清和36例华支睾吸虫病人血清，Cystatin-ELISA检测Sj病人阳性率为98．4％，与正常人及华支睾吸虫病人无交叉反应。其敏感性（98．4％）与SEA－ELISA法的敏感性（93．4％）比较无明显区别（P＞0．05），但特异性显著高于后者（P＜0．05）。Cystatin-ELISA敏感性和特异性亦均高于AWA－ELISA和ES－ELISA。结论 Cystatin-ELISA敏感性高，特异性强，是一种有效的诊断血吸虫病的方法。     

弓形虫pVAX1-SAG2真核表达质粒的构建及其诱导的小鼠免疫应答

目的　构建弓形虫主要速殖子表面抗原 2 (SAG2 )编码基因真核表达质粒pVAX1-SAG2 ,并接种小鼠 ,分析其所诱导的免疫应答。方法　以限制性内切酶EcoRⅠ与KpnⅠ双酶切从重组质粒 pGEM/SAG2中获得SAG2目的基因片段 ,约5 92个bp ,将其插入真核表达载体 pVAX1多克隆位点 ,构建重组质粒 pVAX1-SAG2 ,并转化大肠杆菌JM 10 9,阳性克隆以双酶切与PCR法鉴定。大量提取纯化重组质粒 pVAX1-SAG2 ,5 0 μg肌肉注射小鼠左后腿内侧肌肉 ,3周后加强免疫一次 ;RT-PCR检测SAG2在小鼠肌肉中的转录表达 ,流式细胞仪测定T细胞亚群 ,以速殖子虫体抗原作ELISA测定小鼠血清IgG抗体。结果　真核表达重组质粒 pVAX1-SAG2双酶切鉴定及PCR扩增结果与预期结果相符合。RT -PCR从注射部位肌肉组织总RNA中扩增出SAG2目的基因条带 ;重组质粒 pVAX1-SAG2免疫组CD+ 4 细胞数为 32 .35± 5 .38,显著高于空质粒pVAX1及生理盐水 (NS)二对照组 (P <0 .0 1) ,后二者CD+ 4 细胞数分别为 19.6 5± 4 .2 1与 17.84± 1.5 9;免疫组CD+ 8细胞数为 18.6 7± 2 .37,但与空质粒及NS对照组相比 ,差别不显著 (P >0 .0 5 )。ELISA测定结果显示 pVAX1/SAG2免疫组小鼠血清中出现抗弓形虫特异性IgG抗体。结论　构建成功SAG2真核表达重组质粒 pVAX1-SAG2 ,其能在     

谷氨酸脱羧酶抗体检测及其应用

谷氨到脱羧枰是Ⅰ型糖尿病的关键始动靶抗原。谷氨酸脱羧酶抗体是Ⅰ型糖尿病及糖尿病前期个体的特异性免疫标志。谷氨酸脱羧酶抗体的测定方法主要有免疫沉淀酶活性分析法、放射免疫分析法、放射配体分析法、酶联免疫吸附分析法等。谷氨酸脱羧酶抗体的测定对Ⅰ型糖尿病的预测、鉴别诊断、指导预防和治疗及免疫预防的监测具有重要价值。