SARS冠状病毒E蛋白DNA疫苗的构建及其实验免疫研究

目的构建SARS冠状病毒(SARS-CoV)小囊膜蛋白(E蛋白)的DNA疫苗pVAC-E,观察其在小鼠中诱导的免疫应答。方法采用PCR方法体外扩增SARS冠状病毒E蛋白的基因片段,克隆入真核表达载体pVAC,构建pVAC-E重组质粒。通过脂质体介导瞬时转染非洲绿猴肾(Vero)细胞,Western-blot鉴定E蛋白在细胞中的表达。以基因枪方式免疫小鼠,ELISA检测小鼠血清特异性抗体,MTT法测定淋巴细胞转化率,流式细胞仪检测小鼠脾脏T淋巴细胞亚群分布。结果成功构建SARS-CoVDNA疫苗pVAC-E。Western-blot结果示,转染后的Vero细胞可表达一约9kD大小能被SARS病人血清特异识别的蛋白条带。免疫小鼠中未检测到明显的抗体滴度升高。淋巴细胞转化率在免疫组和对照组间无差别(P>0.05)。脾脏T淋巴细胞亚群分析示免疫组小鼠CD4+细胞显著升高(P<0.05),CD8+细胞与对照组相比无显著差异。结论构建的真核表达质粒pVAC-E能在Vero细胞中表达,表达产物具免疫活性,免疫小鼠后能诱导一定的细胞免疫应答。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。     

血水草生物碱致钉螺肝脏蛋白质差异表达分析

目的分析血水草生物碱(ECA)致钉螺肝脏蛋白质表达的变化。方法10mg/LECA浸泡钉螺36h后,解剖活钉螺并收集肝脏,双向电泳分离ECA组和清水对照组钉螺肝脏蛋白质,ImageMaster2D5.0软件分析图谱,筛选差异蛋白质,并用MALDI-TOF-TOF质谱进行鉴定。结果ECA组和清水对照组分别检出(354±110)、(311±12)个蛋白点;质谱鉴定获得假定蛋白、ENSANGP00000022175蛋白、醛脱氢酶、未知蛋白、ENSAN-GP00000027067蛋白、类似锚蛋白3的1亚型4亚亚型蛋白、相似A型肝炎病毒短型细胞受体1的蛋白、线粒体异柠檬酸脱氢酶2样蛋白、类似角蛋白的蛋白、角蛋白10、角蛋白1共11个蛋白质,这些蛋白质均为ECA处理后表达上调的蛋白质。结论ECA可引起钉螺肝脏蛋白质表达发生改变。     

日本血吸虫成虫性别差异蛋白的筛选及鉴定

目的 筛选和鉴定日本血吸虫成虫性别差异蛋白.方法 自日本血吸虫(Schistosomajaponicum,S.japonicum)尾蚴感染的2只家兔颈动脉灌注生理盐水冲虫,分别收集雌雄成虫各约200条.提取雌、雄成虫的水溶性和脂溶性蛋白各300μg,采用双向凝胶电泳技术分别进行分离.银染后扫描成像,用ImageMaster Platinum 2D 5.0软件进行分析,筛选差异蛋白,并予质谱鉴定.结果 雌虫和雄虫的水溶性蛋白分别检出(255±10)、(224±12)个蛋白点,疏水蛋白分别检出(200±11)、(132±8)个蛋白点;鉴定的6个差异蛋白质中,5个雌性表达上调的差异蛋白为硫氧还蛋白,铁蛋白-1重链,泛素结合酶样蛋白Mms2-泛素复合体可溶性结构B链,热休克蛋白10和胞浆脂肪酸结合蛋白突变体H,1个雄性表达上调的差异蛋白为48 kDa组胺受体亚基肽4.结论 获得了日本血吸虫成虫性别差异蛋白质.     

弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核表达质粒的构建

目的 构建弓形虫RH株致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒。方法 参照GRA8序列分别设计引物。采用PCR从弓形虫RH株基因组DNA中分别扩增出编码GRA8的基因片段，克隆至pMD18-T载体；菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析；各组阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl，分别转化大肠杆菌BL21和JM109,PCR和酶切鉴定转化菌落的插入序列；将构建的原核表达菌株经IPTG诱导，SDS—PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达；将构建的真核重组表达质粒免疫小鼠，观察其诱导的抗体应答。结果 PCR扩增出GRA8基因的特异片段。各组阳性克隆的序列正确，并分别被亚克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2和真核表达载体pVAXl上，构建了弓形虫致密颗粒抗原GRA8的原核和真核重组表达质粒；原核表达质粒在大肠杆菌中表达了GRA8的融合蛋白；真核重组表达质粒诱导小鼠产生了抗弓形虫抗原的抗体。结论以pGEX-4T-2和pVAX1为载体，分别成功构建了GRA8的原核和真核重组表达质粒     

日本血吸虫SJCHGC02377蛋白部分片段的克隆与表达

目的:克隆和表达日本血吸虫SJCHGC02377蛋白。方法:采用RT-PCR从日本血吸虫成虫总RNA中扩增出编码SJCHGC02377蛋白的基因片段;经克隆和测序分析后,亚克隆至表达载体pET-23 a(+),转化大肠埃希菌BL21,菌落PCR和双酶切鉴定;阳性菌株经IPTG诱导表达SJCHGC02377蛋白部分片段,亲和层析予以纯化。结果:RT-PCR扩增出SJCH-GC02377蛋白基因片段;获得的阳性克隆序列与GenBank中登录的日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的基因序列一致;SJCH-GC02377蛋白基因被亚克隆到原核表达载体pET-23 a(+),在BL21中获得了表达,表达的蛋白经亲和层析获得纯化。结论:成功构建了日本血吸虫SJCHGC02377蛋白的重组表达质粒,在大肠埃希菌中获得表达。     

湖南某校医学生实验室安全知识调查干预研究

目的:了解医学生实验室安全知识掌握现状,探讨提高医学生实验室安全知识水平的有效途径。方法:用随机整群抽样法抽取293名医学生,随机分为实验组和对照组,基线调查(第一次调查)后实验组学生自学实验室安全知识手册,并在上实验课的时间对其讲解实验室安全知识,对照组则不进行任何干预,而后对两组学生进行第二次实验室安全知识测试。结果:问卷一对照组和实验组在各分数段的成绩均无差异(P>0.05);问卷二实验组在<40和40-分数段的人数为0,明显少于对照组(P<0.05),而80-分数段的人数为84人,明显多于对照组(P<0.05)。对照组两次问卷调查各成绩段的人数无差异(均有P>0.05);实验组问卷二在<40和40-分数段的人数明显少于问卷一(P<0.05),而80-分数段的人数则明显多于问卷一(P<0.05)。结论:医学院校开展实验室安全知识教育非常必要,教育可以提高医学生的实验室安全知识掌握程度。     

日本血吸虫CAI基因的亚克隆表达与免疫保护效果研究

目的　克隆和表达日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)CAI基因,并对表达产物进行免疫保护效果测定,评价其作为血吸虫疫苗候选分子的潜能。　方法　将SjCAI基因亚克隆至pGEX5X3载体,转化入感受态大肠杆菌ER2566,在异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下进行表达,用表达产物免疫小鼠,并设分别注射等体积的弗氏完全佐剂和PBS的两组对照组,观察免疫保护效果。　结果　在IPTG诱导下,表达载体中的SjGST基因与重组的SjCAI基因在大肠杆菌中获得了高效融合表达,将其免疫小鼠,诱导产生了29.87%的减虫率和63.71%的减卵率。　结论　SjCAI基因亚克隆至pGEX5X3载体后可在大肠杆菌中高效表达,表达产物能诱导产生一定水平的抗Sj保护性免疫力     

弓形虫GRA7真核表达质粒的构建

目的:构建弓形虫致密颗粒抗原GRA7的真核重组表达质粒。方法:设计GRA7的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码GRA7的基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达载体pVAX1而构建真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。结果:PCR扩增出GRA7基因的特异片段,所获克隆的序列正确,并被亚克隆到真核表达载体pVAX1,构建了真核重组表达质粒pVAX1-GRA8。结论:成功构建了GRA7的真核重组表达质粒pVAX1-GRA7。