多重聚合酶链反应-单链构象多态性分析检测耐异烟肼结核分枝杆菌

目的　建立耐异烟肼 (isoniazid ,INH )结核分枝杆菌多重聚合酶链反应 单链构象多态性分析 (multiple polymerasechainreaction singlestrandconformationpolymorphism ,multi PCR SSCP)方法 ,快速、特异地同时检出aphC启动子、inhA、katG基因的突变情况 ,用于快速诊断结核分枝杆菌对INH的耐药性。方法　根据结核分枝杆菌的aphC启动子序列、inhA序列、katG序列 ,分别设计出 3对特异性寡聚核苷酸引物 ,采用multi PCR及SSCP技术 ,同时检测对结核分枝杆菌耐INH起作用的这 3个基因的突变情况。结果　对H3 7Rv标准株、临床分离INH敏感株 (2 3株 )及INH耐药株 (3 5株 )分别采用常规PCR和multi PCR同时进行扩增 ,两种扩增方法均能扩增出预期的目的片段 ,且结果符合率达10 0 % ;采用单基因PCR SSCP ,aphC启动子序列突变检出率 17% (6/3 5)、inhA序列突变检出率 2 0 % (7/3 5)、katG序列突变检出率 66% (2 3 /3 5) ;multi PCR SSCP突变检出率 83 % (2 9/3 5)。结论　耐药基因检测指导治疗是一种新探索 ,multi PCR SSCP方法敏感、特异 ,能同时快速有效地检测结核分枝杆菌aphC启动子、inhA、katG 3个INH耐药基因的突变 ,提高检验效率 ,有望成为临床指导用药的好方法。     

抗前列腺癌多肽的可溶性表达及纯化

目的:探讨抗前列腺癌多肽的可溶性融合蛋白的表达条件,并获得其纯化蛋白,为后续的体内、外活性实验奠定基础。方法:采用Phamacia公司商品化的GST融合表达载体pGEX-4T-2,向细菌培养基中加入IPTG后,诱导Ptac启动子下游的外源目的基因表达。通过对不同培养基、不同温度、不同诱导时间及不同诱导剂浓度下可溶性目的蛋白的表达量进行探索,筛选出表达量最高的组合方式,并通过GST亲合层析柱GSTrap FF对获得的可溶性蛋白进行纯化。结果:成功进行了GST-APP216融合蛋白的可溶性表达,在IPTG浓度为0.2 mmol/L,27℃条件下,诱导表达4.5h时表达量最高。经凝胶成像系统进行密度扫描显示,该可溶性蛋白的表达量约占上清总蛋白量的36.2%。并获得了纯化的APP216蛋白,经紫外分光光度计测定标准品,绘制标准曲线。测定260/280nm处吸光度的比值,得到纯化蛋白的浓度为323.1μg/ml。结论:APP216纯化蛋白的获得,为进一步检测抗前列腺癌多肽体外、体内的肿瘤杀伤作用奠定了坚实的实验基础。     

反义c-myc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖

目的 观察反义c-myc寡核苷酸对大鼠气道平滑肌增殖的抑制作用。方法 大鼠气道平滑肌细胞原代培养，4－12代用于实验。利用Lipofectin将正义、反义及错配c-myc寡核苷酸导入大鼠气道平滑肌细胞，MTT法检测不同寡核苷酸对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用，RT－PCR检测c-myc mRNA的表达，免疫组织化学染色检测c-myc蛋白的表达。结果 反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖，且这种抑制作用呈浓度依赖性；反义c-myc寡核苷酸可降低c-myc mRNA的表达，同时降低了c-myc mRNA的翻译。结论 反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌的增殖。     

胃癌、结肠癌中端粒酶活性的检测及临床意义

目的:检测胃癌、结肠癌及其相应正常组织中端粒酶活性,探讨其在胃癌、结肠癌发生中的作川以及与临床病理特征之间的关系。方法:采用PCR-TRAP法检测92例胃癌、结肠癌和61例正常组织的端粒酶活性,并州端粒酶活性与临床病理特征关系进行分析。结果:胃癌和结肠癌中端粒酶活性阳性率为84.9％,而正常组织为9.83％,胃癌和结肠癌组织端粒酶活性显著高于正常组织,P<0.01;胃癌、结肠癌组织中端粒酶活性在不同分化程度及淋巴转移之间未发现显著差异,P>0.05。结论:端粒酶在胃癌、结肠癌的发生中起重要作用;端粒酶在胃癌、结肠癌组织中高表达,而在正常胃肠组织低表达的特性,使其有望成为一种较为理想的胃肠道肿瘤诊断的标志物。     

结核分枝杆菌耐异烟肼基因突变的快速检测

目的：探讨编码过氧化氢-过氧化物酶的katG基因突变与结核分枝杆菌异烟肼(INH)耐药性的相关关系。方法：根据结核分枝杆菌genebank中katG序列，自行设计特异性寡聚核苷酸引物，采用聚合酶链反应-单链构象多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP)分析和直接测序法(direct sequencing，DS)分析结核分枝杆菌中katG基因突变情况．以H37，Rv标准株为对照。结果：所有23株敏感菌均未有SSCP结果异常；35株耐药菌中，有2株(5．7％)katG基因扩增阴性，且发生在高度耐药菌中．进一步分析发现，SSCP法突变检出23株(65．7％)，测序法突变检出24株(68．6％)，符合率为95．8％(23／24)．结论：参照测序法对耐药菌突变序列的分析结果，PCR-SSCP敏感、特异，可快速检测结核分枝杆菌katG耐药基因突变，有利于耐药结核分枝杆菌耐药性的快速检测。     

高迁移率族蛋白-1的结构与细胞外功能

高迁移率族蛋白-1(HMGB-1)是一种核蛋白，属于HMG蛋白超家族，由215个氨基酸组成，相对分子质量为25000，在哺乳动物细胞核内普遍存在。新近发现HMGB-1可由单核／巨噬细胞等通过非经典的、囊介导的分泌通路而分泌至细胞外。细胞外的HMGB-1是一个重要炎症因子，参与多种疾病尤其是类风湿性关节炎、脓毒症、急性肺损伤等的发病机制，甚至可导致动物死亡。对HMGB-1细胞外机制与功能的进一步研究，可对相关疾病的诊断与治疗提供新的策略和靶位。     

端粒酶RNA特异性核酶抑制卵巢癌细胞端粒酶的活性

目的：研究端粒酶RNA特异性核酶对卵巢癌细胞活性的抑制作用。。方法：用脂质体法将构建好的核酶逆转录病毒载体转染至卵巢癌HO－8910细胞，以MTT比色法检测细胞的生长，应用流式细胞仪分析细胞周期细胞，观察细胞的增殖情况，同时扩增端粒重复序列，结合杂交分析，检测细胞的端粒酶活性。结果：MTT检测发现转染核酶后的细胞生长的潜伏期延长（48→72h），对数生长期减缓（4→5d），流式细胞仪结果显示其G1期比例明显增高（70．0％→80．5％，P＜0．01），S期细胞比例明显降低（19．0％→13．7％，P＜0．01），细胞增殖下降，细胞的端粒酶活性亦降低。结论端粒酶RNA特异性核酶能抑制卵巢癌细胞粒酶活性，抑制细胞增殖。     

构建由缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型腺病毒

目的：构建由缺氧反应元件串联重复体修饰的人端粒酶逆转录酶（hTERT)核心启动子引导酵母胞嘧啶脱氨酶FCY1基因表达的复制缺陷型重组腺病毒。方法：人工设计缺氧反应元件串联重复序列，克隆后插入hTERT启动子上游并经测序证实。将修饰后的hTERT启动子和酵母胞嘧啶脱氨酶基因FCY1插入穿梭质粒，与辅助质粒共转染HEK293细胞，重组产生复制缺陷型腺病毒。结果：获得了由3倍和6倍缺氧反应元件修饰的hTERT核心启动子引导FCY1基因表达的复制缺陷型重组腺病毒。结论：基于Cre重组酶／loxP的腺病毒载体构建系统操作简便、重组效率高。