紫杉醇对卵巢癌细胞作用的浓度依赖性及其机制探讨

目的 探讨不同浓度紫杉醇对卵巢癌细胞发挥抗癌效应的内在机制.方法 以0.01、0.1、1、10、50 μmol/L紫杉醇作用于人卵巢癌细胞系A2780,采用碘化丙啶(PI)单染法流式细胞术检测不同浓度紫杉醇作用下细胞周期的变化情况.进而对细胞进行同步化处理,采用PI单染法流式细胞术分析低浓度(0.01 μmol/L)紫杉醇对细胞周期的影响;Annexin Ⅴ/PI双染法流式细胞术分析高浓度(50 μmol/L)紫杉醇对A2780细胞坏死的影响.结果 ①紫杉醇浓度为0.1、1、10 μmol/L时,G2/M期细胞比例明显高于0.01 μmol/L组(P<0.01)和50 μmol/L组(P<0.01).②A2780细胞经同步化处理后给予0.01 μmol/L紫杉醇,经过一个细胞倍增时间未观察到G0/G1期阻滞.③0.01 μmol/L组,1 μmol/L组坏死细胞比例明显低于50 μmol/L组(P<0.01).结论 在0.1～10 μmol/L 的浓度范围内,紫杉醇可能通过诱导G2/M期阻滞使卵巢癌细胞发生凋亡,浓度为0.01 μmol/L时紫杉醇诱导凋亡与G0/G1期或G2/M期阻滞均无关,浓度为50 μmol/L时紫杉醇可能主要通过诱导细胞坏死发挥抗癌效应.     

糖原合酶激酶-3β磷酸化抑制紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡的实验研究

目的:探讨增加糖原合酶激酶-3β(GSK3β)的p-GSK3β对紫杉醇诱导的卵巢癌细胞凋亡的作用.方法:运用GSK3β特异性抑制剂氯化锂(LiC1)增加GSK3β的磷酸化水平,应用流式细胞仪和Hochest33342染色检测细胞凋亡和细胞周期,蛋白质印迹法检测GSK3β及GSK3β磷酸化水平.结果:蛋白质印迹法显示,抑制剂LiC1作用后,GSK3β磷酸化明显增加.流式结果显示,90 nmol/L紫杉醇作用于OV2008细胞24 h,通过亚G1峰检测其凋亡卒为(29.75±1.54)0A,而应用LiC1抑制剂预孵育的细胞,凋亡率为(15.23±0.95)%,差异有统计学意义,t=46.378,P=0.002.Hochest33342染色证实LiC1作用后可明显抑制紫杉醇诱导的细胞凋亡形态学改变.流式结果周期分析显示,90 nmol/L紫杉醇作用于OV2008细胞24 h,与正常对照相比[G2M(22.83±2.40)%],可见细胞呈现明显的G2M期阻滞[G2M(69.68±1.48)%],而LiC1抑制剂的应用,可增强紫杉醇诱导的G2M期阻滞[G2M(88.49±0.86)%],差异有统计学意义,t=20.407,P=0.003.结论:GSK3β磷酸化增加可抑制紫杉醇诱导的卵巢癌细胞的凋亡并增强其周期阻滞.     

RNAi文库在肿瘤研究中的应用

RNAi文库技术早期应用于低等真核生物研究中,随着RNAi技术在哺乳动物研究中的广泛应用.RNAi文库已作为研究功能性基因组的有效方法应用于哺乳动物的研究中.RNAi文库有两种类型,一种由合成寡核苷酸组成.一种由质粒载体构成.其筛选方法也有两种:高通量筛选和选择性筛选.短发卡RNA(shRNA)能在细胞内转变成具有siRNA性质的短双链RNA,且各种shRNA真核表达载体能稳定整合人细胞基因组产生持续的基因沉默效应.应用shRNA文库结合适当的筛选方法将是寻找肿瘤信号通路中的新组分.将为寻找肿瘤药物治疗新靶点提供有效的途径.     

肿瘤转移抑制基因KAI1对子宫内膜癌细胞增殖、侵袭能力的影响

目的:探讨肿瘤转移抑制基因KAI1基因对子宫内膜癌细胞(AN3CA和HEC-1-B)增殖及侵袭能力的影响。方法:脂质体介导pcDNA3-KAI1质粒转染人子宫内膜癌细胞AN3CA和HEC-1-B,采用免疫印迹法和流式细胞术检测转染前后肿瘤细胞KAI1蛋白的表达,MTT比色法、软琼脂克隆形成实验观察KAI1基因对肿瘤细胞增殖能力的影响,Transwell侵袭实验检测转染前后肿瘤细胞侵袭能力的变化。结果:转染pcDNA3-KAI1质粒后AN3CA和HEC-1-B细胞内和细胞表面均可检测到KAI1蛋白的稳定表达。转染空白质粒组细胞形成克隆数量多体积较大,细胞克隆形成率为(54.2±3.1)%和(52.7±4.3)%,细胞的倍增时间为21.3h和20.1h;基因转染pcDNA3-KAI1质粒组细胞形成克隆数少体积较小,细胞克隆形成率为(37.4±5.1)%和(32.1±3.7)%,细胞的倍增时间为43.7h和45.2h;两组间细胞增殖能力和克隆形成能力比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。基因转染组细胞的穿膜细胞数为(91±10.7)/HT、(68±10.8)/HT,而空质粒转染组细胞的穿膜细胞数为(292±11.5)/HT、(219 12.7)/HT,两组细胞比较,侵袭能力亦显著下降(P<0.05)。结论:外源性肿瘤转移抑制基因KAI1有效转染可使子宫内膜癌细胞增殖、侵袭能力均下降,KAI1可能成为子宫内膜癌转移的新治疗靶点。     

肿瘤转移抑制基因KAI1/ CD82 和雌孕激素受体在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义

 目的 探讨转移抑制基因KAI1／CD82和雌孕激素受体（ER、PR）在子宫内膜癌组织中的表达及与淋巴结转移的关系，并分析其临床意义。方法 应用SP法对76例子宫内膜癌组织中KAI1、PR、ER的蛋白表达情况进行观察。结果 子宫内膜癌组织中KAI1和PR的阳性表达与手术病理分期、组织学分级、肌层浸润深度呈负相关（ P _{KA H}=0．0089、0．0103、0．0356，P_PR=0．0026、0．000、0．0053）；伴有盆腔淋巴结转移、宫旁或附件受累及的组织KAI1、PR、ER的阳性表达均明显低于无转移的组织（PKAII=0．0091、0．0073，PR=0．0006、0．0074，P _ER=0．0129、0．0073）；ER的阳性表达与FIGO分期呈负相关（P=0．0226）；不同的病理类型中，只有PR表达差异有统计学意义（P=0．0446）；而三者的表达与患者年龄及宫颈是否受累均无关。KAI1、PR、ER表达阴性和阳性的生存率差异均有统计学意义（ P _{KA H}=0．0043，P_PR=0．0010，P _ER=0．0124）。Logistic回归模型分析结果提示：KAI1、PR、ER三个变量中只有KAI1与淋巴结转移有关（P=0．0400，OR=0．245）。COX比例风险回归模型分析结果显示：KAI1、PR、ER表达均不是子宫内膜癌的独立预后因素。结论 KAI1表达与子宫内膜癌的淋巴结转移具有相关性，其可作为临床预测子宫内膜癌患者发生淋巴结转移和评估预后的综合指标之一。KAI1在子宫内膜癌发展中所起的作用可能与PR有关，KAI1、PR、ER的缺失表达与子宫内膜癌的发展、治疗及预后密切相关。     

Reversal of Multidrug Resistance and Inhibition of Phosphorylation of AKT in Human Ovarian Cancer Cell Line by Wild-type PTEN Gene

The reversing effect of wild-type PTEN gene on resistance of C13K cells to cisplatin and its inhibitory effect on the phosphorylation of protein kinase B (AKT) were studied. The expression of PTEN mRNA and protein in OV2008 cells and C13K cells were semi-quantitatively detected by using RT-PCR and Western blotting. Recombinant eukaryotic expression plasmid containing human wild-type PTEN gene was transfected into C13K cells by lipofectamine2000. The expression of PTEN mRNA was monitored by RT-PCR and the expression of PTEN, Akt, p-Akt protein were ana- lyzed by Western blotting in PTEN-transfected and non-transfected C13K cells. Proliferation and chemosensitivity of cells to DDP were measured by MTT, and cell apoptosis was detected by flow cytometry after treatment with cisplatin. The expression of PTEN mRNA and protein in OV2008 cells were significantly higher than those in C13K cells. After transfection with PTEN gene for 48 h, the expression of PTEN mRNA and protein in C13K cells were 2.04±0.10, 0.94±0.04 respectively and the expression of p-Akt protein ( 0.94±0.07) was lower than those in control groups (1.68±0.14, 1.66±0.10) (P< 0.05). The IC50 of DDP to C13K cells transfected with PTEN (7.2±0.3 μmol/L) was obviously lower than those of empty-vector transfected cells and non-transfected cells (12.7±0.4 μmol/l, 13.0±0.3 μmol/L) (P<0.05). The apopototis ratio of wild-type PTEN-transfected, empty vector transfected and non-transfected C13K cells were (41.65±0.87)%, (18.61±0.70)% and (15.28 ±0.80)% respectively, and the difference was statistically significant (P<0.05). PTEN gene plays an important role in ovarian cancer multidrug resistance. Transfection of PTEN could increase the ex- pression of PTEN and restore drug sensitivity to cisplatin in human ovarian cancer cell line C13K with multidrug-resistance by decreasing the expression of p-Akt.     

肿瘤转移抑制基因KAI1在子宫内膜癌原发灶和转移灶组织中的表达及其临床意义

目的:研究子宫内膜癌原发灶和转移灶组织中KAI1蛋白的表达并探讨其临床意义。方法:应用免疫组化S-P法检测KAI1蛋白在子宫内膜癌76例原发肿瘤和44例转移肿瘤中的表达,并分析其与临床病理特征的关系。结果:子宫内膜癌原发灶组织中KAI1的阳性表达随着手术-病理分期(P=0.0089)、组织学分级(P=0.0103)增高及深肌层浸润(P=0.0356)而降低,并与盆腔淋巴结转移(P=0.0091)、宫旁或附件受累(P= 0.0073)呈显著相关,与年龄(P=1.0000)、宫颈是否受累(P=0.0911)以及病理类型(P =0.7927)均无相关性。KAI1在子宫内膜癌的肌层浸润癌灶组织和淋巴结转移癌灶组织中的阳性表达差异有统计学意义(P=0.01)。KAI1表达阴性组和阳性组的生存率差异具有统计学意义(P=0.0043),多因素分析显示KAI1表达不是子宫内膜癌的独立预后因素。结论:KAI1蛋白在子宫内膜癌的发展进程中表达缺失,它可能作为临床预测子宫内膜癌患者发生淋巴结转移和评估预后的综合指标之一。     

纤维粘附素介导的卵巢癌细胞粘附耐药的实验研究

目的:探讨纤维粘附素(FN)介导的卵巢癌细胞与胞外基质粘附对耐药的影响,并检测细胞粘附耐药时凋亡抑制基因Survivin的表达。方法:建立FN介导的细胞粘附模型,设定为粘附耐药(FN)组,以未铺纤维粘附素接种细胞为对照(NOFN)组。经细胞增殖实验(MTT)检测不同浓度(0.1、1.0、10.0、100.0μmol/L)紫杉醇(Taxol)对粘附耐药组和对照组细胞(A2780、SW626)生存率的影响,用流式细胞仪(FACS)检测2组细胞50μmol/L紫杉醇作用24h后的细胞凋亡率,蛋白质免疫印迹法(Westernblot)和流式细胞仪(FACS)检测细胞粘附耐药形成前后Survivin蛋白的表达。结果:MTT检测结果显示细胞株A2780和SW626经不同浓度的紫杉醇作用后FN组细胞生存率均明显高于NOFN组(P均<0.05)。FACS检测结果显示两株细胞FN组细胞凋亡率均明显低于N0FN组(P均<0.05)。Westernblot和FACS法检测结果显示,两株细胞FN组Survivin蛋白表达均明显高于N0FN组(P<0.05)。结论:纤维粘附素(FN)可能通过上调Survivin的表达介导卵巢癌细胞粘附耐药。     

真核表达survivin基因对曲古菌素A诱导卵巢癌细胞凋亡作用的影响

目的　探讨survivin 基因对曲古菌素A( TSA) 诱导卵巢癌细胞凋亡作用的影响。方法　(1) 将本实验室已构建成功的survivin 正义全长真核表达质粒(pcDNA 3. 1-urvivin) ,经脂质体包裹转染人卵巢癌细胞A2780 ,以转染pcDNA 3. 1空载体的A2780 细胞为对照。(2) RT2PCR 和Western blot 方法分别检测survivin mRNA 和蛋白质的表达。(3) MTT 比色法和流式细胞仪(FACS) 分别检测TSA 对两组细胞存活率和凋亡率的影响。(4) Western blot 检测TSA 作用下A2780 细胞中survivin 蛋白的表达变化。结果　(1) RT-PCR和Western blot 检测提示转染pcDNA 3. 1-urvivin 组中survivin mRNA 和蛋白质表达明显高于空载体组。(2) MTT 比色法和FACS 检测提示转染pcDNA 3. 1-urvivin 组细胞存活率明显高于空载体组,细胞凋亡率明显低于空载体组,差异有统计学意义( P<0. 05) 。pcDNA 3. 1-urvivin转染后的2780 细胞对TSA 的敏感性明显降低。(3) Western blot 检测提示survivin 的表达水平随着TSA 作用时间的延长而下降。结论　曲古菌素A 诱导卵巢癌细胞的凋亡作用可能与survivin 基因表达有关。