真核表达Survivin基因对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性的影响

目的探讨Survivin基因对卵巢癌细胞紫杉醇（Taxol）敏感性的影响。方法构建Survivin正义全长真核表达质粒（pcDNA3．1-Survivin），经脂质体包裹转染人卵巢癌细胞A2780，以转染pcDNA3．1空载体的A2780细胞为对照。RT—PCR和蛋白质免疫印迹（Western blot）法检测Survivin mRNA和蛋白质的表达；MTT比色法检测紫杉醇对两组细胞存活率的影响；流式细胞仪（FACS）检测细胞凋亡率。结果①RT—PCR和Western blot检测提示转染pcDNA3．1-Survivin组中Survivin mRNA和蛋白质表达明显高于空载体组。②MTT比色法和FACS检测提示转染pcDNA3．1-Survivin组细胞存活率明显高于空载体组，细胞凋亡率明显低于空载体组，差异均有显著性意义（P〈0．05）。pcDNA3．1-Survivin转染后的A2780细胞对紫杉醇的敏感性明显降低。结论卵巢癌对紫杉醇的耐药性可能与Survivin基因表达有关。     

三位点短发卡状RNA在提高RNA干扰效率中的作用

背景与目的:shRNA技术是近来发展的热点技术之一,但普遍采用的单位点shRNA干扰载体效果并不理想.本研究探讨三位点短发卡状RNA在提高RNA干扰效率中的作用.方法:构建外源基因DsRed全长载体转染HEK293细胞.针对报告基因DsRed设计4个干扰载体,一个含有3段shRNA,另外3个分别含有此3段中1段shRNA.转染293/DsRed,荧光显微镜观察基因DsRed.应用实时定量PCR(Real-time PCR)和流式细胞仪(FACS)检测4个载体对DsRed基因在mRNA及蛋白水平干扰效应.结果:4个载体对靶基因DsRed在mRNA及蛋白水平均有干扰效应,且含有3段shRNA载体对DsRed基因干扰效率为(89±16)%,显著高于3个只含有1段shRNA载体[(50±23)%,(52±15)%,(55±27)%],差异有显著性(P<0.05).结论:三位点shRNA干扰载体可以提高对靶基因的干扰效率.     

人卵巢癌细胞SKOV3对硼替佐米和紫杉醇联合应用的药物敏感性及可能机制

背景与目的:蛋白酶体抑制剂硼替佐米是新型抗癌药物,体外对多种恶性肿瘤细胞均具有良好的疗效.本实验研究硼替佐米与紫杉醇单独及联合应用对人卵巢癌细胞株SKOV3的存活率和凋亡率的影响,并对糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)和髓样白血病-1基因(Mcl-1)在其诱导细胞凋亡中的作用机制进行探讨,为临床治疗卵巢癌提供理论依据.方法:用50 nmol/L硼替佐米、90 nmol/L紫衫醇,或50 nmol/L硼替佐米联合90 nmol/L紫衫醇分别作用于SKOV3细胞12、24、36、48及72 h后,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞增殖活性,并计算细胞存活率,Annexin-V/PI法流式细胞仪检测细胞凋亡率,蛋白质免疫印迹法(Westernblot)检测相关蛋白表达水平.结果:50 nmol/L硼替佐米和90 nmol/L紫衫醇联合作用于SKOV3细胞,12、24、36、48及72 h时间点细胞存活率分别为(65.2±5.8)%,(58.3±14.4)%, (35.3±5.0)%,(19.2±1.5)%和(11.4±2.5)%,与紫杉醇单用组比较,细胞生长抑制增强,差异有显著性(P<0.05).药物单独或联合作用细胞24 h后,紫杉醇单用组、硼替佐米单用组和两者联用组细胞凋亡率分别为(14.7±0.5)%、(15.1±0.8)%和(20.5±0.7)%,硼替佐米与紫杉醇联用组凋亡率显著增高(P<0.05).药物处理细胞后,经免疫印迹法检测p-GSK-3β和Mcl-1蛋白表达水平,硼替佐米与紫杉醇联用组p-GSK-3β和Mcl-1表达水平降低最为明显,分别为正常细胞组表达水平的(19.3±0.4)%和(31.6±3.1)%,差异均有显著性(P<0.05).硼替佐米和紫杉醇单用组中p-GSK-3β表达水平有所降低,分别为正常细胞组的(78.7±1.2)%和(85.1±1.6)%,Mcl-1表达水平分别为对照组的(68.2±4.5)%和(57.0±4.1)%,差异均具显著性(P<0.05).结论:硼替佐米与紫杉醇联用能增强人卵巢癌细胞对紫杉醇的药物敏感性,并促进GSK-3β磷酸化Mcl-1,使其降解,诱导细胞,GSK-3β/Mcl-1信号通路可能在硼替佐米与紫杉醇联用诱导凋亡中发挥了重要作用.     

氯化锂对卵巢癌细胞增殖凋亡影响及其机制探讨

目的：观察氯化锂（1ithiumchloride,LiCl）对卵巢癌sKOV3细胞增殖活性及凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法：使用20（A组）、40（B组）和60（C组）mmol／LLiCl处理sKOV3细胞,正常对照组用等体积的细胞培养基培养。采用CCK8法观察LiCl对卵巢癌SKOV3细胞增殖活性的影响;流式细胞仪检测LiCl作用后细胞周期变化及凋亡情况。蛋白质印迹法检测细胞糖原合成酶激酶-3β（glycogensynthasekinase317,GSK-3β）、磷酸化糖原合成酶激酶-317（phos—phorglation—glycogensynthasekinase3β,p-GSK-3β）及有丝分裂阻滞缺陷蛋白2（mitoticarrestdeficient2,MAD2）蛋白表达的变化。结果：不同浓度LiCl分别作用于SKOV3细胞48h后,A组细胞增殖活性为（80．64±1．06）％,与B组（57．18±1．56）％比较,差异有统计学意义,P=0．001;与C组（43．18±6．12）％比较,差异有统计学意义,P〈0．001。B组作用24h细胞增殖活性为（75．12±9．35）％,48h为（57．18±1．56）％,72h为（35．36±1．00）％,与24h组相比,48h组（P=0．158）和72h组（P=0．036）细胞增殖活性降低。LiCl能有效抑制SKOV3细胞增殖,呈时间与剂量依赖性。不同浓度LiCl作用96h后SKOV3细胞的凋亡率相对于对照组升高,A组为（7．82±0．87）％,P=0．037;B组为（21．09±1．57）％,P〈O．001;C组为（27．83士0．47）%,P〈O．001,差异均有统计学意义。不同浓度LiCl作用48h后,细胞出现了明显的G2／M期阻滞,G2／M期的比例由对照组的（10．23±1．50）％依次升高,A组为（19．9±4．16）％,P=0．352;B组为（30．29±0．51）％,P=0．045;C组为（39．32±1．11）％,P=0．009,差异有统计学意义。蛋白质印迹法检测结果显示,LiCl浓度升高,p-GSK-3β蛋白相对表达量升高,A组为（54．39±2．75）％,P=0．019;B组为（72．39土2．89）％,P=0．009;C组为（86．57±2．52）％,P=0．005,差并有统计学意义。LiCl浓度升高,MAD2蛋白相对表达量升高,A组为（52．29土1．34）％,P=0．041;B组为（58．35±1．36）％,P=0．030;C组为（72．07±2．93）%,4,P=0．006,差异有统计学意义。结论：LiCl能有效抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖,并诱导其凋亡;上调MAD2增强有丝分裂检测点功能,最终导致细胞G2／M期阻滞可能是LiCl抑制增殖促进凋亡的机制。     

卵巢癌细胞上皮间质转化及侵袭转移过程中microRNA-9的调控作用

目的 探讨microRNA-9（miR-9）参与调控卵巢癌细胞EMT过程,以及影响卵巢癌细胞侵袭及转移的分子机制。方法 使用TargetScan及PicTar数据库,预测可能靶向E-cadherin 3’UTR区的miRNA,双荧光素酶报告体系进行验证;上调候选miR后,用qRT-PCR和Western blot检测E-cadherin的表达变化;细胞免疫荧光观察E-cadherin、β-Catenin和Vimentin的表达;划痕实验、Transwell实验,观察卵巢癌细胞运动和侵袭能力的改变。结果 TargetScan、PicTar预测发现miR-9是唯一可与CDH1结合的miRNA。双荧光素酶报告系统验证预测结果正确。在SKOV-3中上调miR-9后,E-cadherin的表达受到显著抑制;细胞形态向间质细胞样转变,发生EMT分子水平的特征性改变;体外实验表明,卵巢癌细胞的运动和侵袭能力得到明显促进。结论 miR-9可以通过靶向调控E-cadherin表达,促进卵巢癌细胞的EMT进程,对卵巢癌细胞的运动和侵袭能力产生重要影响。     

三位点GSK3β shRNA 真核表达质粒的构建及鉴定

 目的：构建三位点干扰GSK3β基因的高效shRNA表达质粒载体。 方法：用DNA重组技术将针对人GSK3β基因不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到高效RNAi真核表达质粒载体pshRNA-U3中,构建shRNA表达载体pshRNA-U3/GSK3β。脂质体介导转染人卵巢癌细胞株OV2008,流式细胞仪检测转染效率。运用实时定量PCR和Western blot分别检测RNA水平和蛋白水平GSK3β的干扰效果。运用流式细胞仪检测紫杉醇诱导的凋亡率。 结果：经测序证实成功构建携带3个GSK3β shRNA的表达载体pshRNA-U3/GSK3β。RT-PCR和 Western blotting均证实重组质粒pshRNA-U3/GSK3β转染OV2008后可明显降低细胞内GSK3β mRNA丰度及GSK3β蛋白表达。FACS显示,干扰GSK3β可抵抗紫杉醇诱导的凋亡。 结论：成功构建了针对GSK3β的三位点shRNA表达载体pshRNA-U3/GSK3β,并进行了初步的功能效应验证,为进一步研究GSK3β 蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础。     

短发卡状RNA抑制人Bub1基因表达及其对人卵巢癌A2780细胞药物敏感性和周期的影响

背景与目的:既往研究提示,紫杉醇类药物作用的发挥有赖于功能完整的纺锤体检查点,而Bubl是纺锤体检查点的重要组成部分.本研究旨在探讨Bubl短发卡状RNA真核表达载体稳定转染对人卵巢癌A2780细胞紫杉醇敏感性及细胞周期的影响.方法:构建Bubl基因短发卡状RNA真核表达载体pEGFP-Bubl-shRNA,以脂质体Lipofectamine~(TM)2000包裹空质粒转染体外培养的人卵巢癌细胞株A2780后进行稳定筛选.应用RT-PCR、Western印迹法分析目的基因mRNA及其蛋白水平的表达情况:MTT法、流式细胞术等方法检测转染前后,A2780细胞对紫杉醇敏感性及其细胞周期的变化;Hoechst33342染色法检测细胞分裂指数.结果:与对照组pEGFP-Cl/A2780及A2780组相比,pEGFP-Bubl-ShRNA/A2780组细胞中mRNA和蛋白水平的表达均明显下降,其差异具有统计学意义(P＜0.05);MTT检测结果提示,转染pEGFP-Bubl-shRNA质粒后细胞对紫杉醇的敏感性明显降低,与对照组相比,差异具有统计学意义(P＜0.05);流式细胞术检测结果显示,紫杉醇1 μ mol/L处理细胞24及48 h后,与pEGFP-Cl/A2780及A2780组相比,该组细胞凋亡率明显降低(P＜0.05),G_2/M期细胞比例下降,差异具有统计学意义(P＜0.05);Hoechst33342染色提示,与对照组相比,pEGFP-Bubl-shRNA/A2780组的分裂指数(MI)明显降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).结论:Bubl基因的下调可导致人卵巢癌A2780细胞对紫杉醇敏感性及G_2/M期细胞比例下降.pEGFP-Cl-shBubl质粒的成功构建,为研究Bubl基因的功能及定位的研究提供了进一步的实验条件.     

硼替佐米联合顺铂对卵巢上皮性癌顺铂耐药细胞化疗敏感性的影响

Objective To explore the sensitivity and the molecular mechanism of cisplatinresistance ovarian cancer cell line C13 to proteasome inhibitors and the combination with cisplatin. Methods After different treatments, methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay was applied to examine the cell viability, annexin-V/propidium iodide(PI) apoptosis detection kit was used to determine the apoptosis rate of different groups, western blot assay was introduced to evaluate the expression levels of Fas-associated death domain-like interleukin-1 beta converting enzyme inhibitory protein (cFLIPs), and the activity of caspase-8 was examined. Results MTT assay shown that the cell viability ratios of combination group at serial time points from 12, 24, 36, 48, 60, 72 hours were ( 56.0 ± 8.4 ) %, (44.7 ± 7.3 ) %, ( 33.7 ±11.2) %, (27.6 ± 8.0) %, (27. 6 ± 7.6) % and (28.1 ± 2.4) %, which were much lower than those of cisplatin group (P <0.05). After treated for 24 hours, apoptosis rates of cisplatin group, bortezomib group and combination group were ( 16.7 ± 1.7) %, (23.4 ± 2.1 ) % and (26.9 ± 1.6) %, respectively. The rate of combination group was much higher than that of non-treated group and that of cisplatin group or bortezomib group ( P < 0.05 ). Western blot assay showed the changes of expression levels of cFLIPs, which were downregulated seriously after cisplatin, bortezomib or combination treatment [ (43.2 ± 2.3 )% vs( 75.7 ± 3.0)%vs (67.9 ± 2.1 ) %, P < 0.05 ]. The caspase-8 activity of combination group was (5.6 ± 1.6) folds than that of non-treated group, which was higher than those of other two groups [ ( 2.3 ± 1.0) and (4.2 ± 0.9 ) folds,P < 0.05 ]. Conclusions The tumor cell lethal effect of cisplatin could be increase significantly by the combination application of proteasome inhibitors, bortezomib. And the cFLIPs/caspase-8 signaling pathway may be play an important role in the molecular mechanism of the combination treatment.     

miR-125b在前列腺癌1E8细胞运动转移中的作用及其分子机制的初步探讨

目的 研究 miR-125b在前列腺癌高低转移潜能细胞中的表达差异及其对高转移细胞株1E8细胞的运动转移中的作用和可能的分子机制.方法 realtime PCR法检测前列腺癌高低转移潜能配对细胞系中 miR-125b的表达差异.通过划痕实验及transwell实验观察1E8细胞及转染 miR-125b 抑制剂及其阴性对照后该细胞运动转移能力的变化.结果 realtime PCR结果显示高转移潜能1E8细胞中miR-125b表达水明显高于低转移潜能2B4细胞;下调miR-125b会减弱1E8细胞的运动转移能力.结论 miR-125b可促进前列腺癌细胞的运动转移能力.     

乳腺癌相关成纤维细胞的分离培养及鉴定

目的:分离培养和鉴定乳腺癌相关成纤维细胞及其与之配对的正常乳腺成纤维细胞,并初步探讨两者生物学性状的差异.方法:用胶原酶消化法获得原代乳腺癌相关成纤维细胞及其与之配对的正常乳腺成纤维细胞,通过显微镜观察细胞形态,免疫荧光观测上皮细胞和成纤维细胞标记,MTT及Western检测两者之间生物学性状差异.结果:分离得到乳腺癌相关成纤维细胞及其与之配对的正常乳腺成纤维细胞,两者均高表达Vimentin低表达cytokeratin,且两者在形态及生物学性状有一定差异.结论:与配对成纤维细胞相比,乳腺癌相关成纤维细胞高表达α-SMA,且增殖能力增强.