pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化

目的构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础。方法设计并合成两端分别带5出l和Bgl II酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2（＋）-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT会长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3＇末端加“A”并纯化．然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TEasy Vector中得到pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核甘酸,两端分别引入Nde I和Xho I酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal I-Bgl II和Xho I-BamH I双酶切,利用同尾酶（Sol I与Xho I,Bgl II与BamH I）能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。将鉴定正确的pET15b-PEP-1．CAT重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导目的蛋白表达。然后利用重组蛋白N端的组氨酸“标签”（His-tag）对其进行金属螯合亲和层析纯化。结果测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1由序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。SDS-PAGE和Westernblot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E-coli中获得可溶性高表达,经Ni^2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15U／g,结论成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础。     

阿霉素诱导大鼠心衰模型的建立

目的:通过阿霉素(Adriamyc in,ADR)腹腔注射给药(Adriamyc in,ADR)试图造成大鼠心衰,探讨建立大鼠阿霉素心衰动物模型的给药方案,为研究心衰的发病机制和有效治疗措施提供理想的动物模型。方法:雄性W istar大鼠25只,随机分成模型组(n=15)和对照组(n=10)。模型组:腹腔注射ADR(4 mg/kg,用注射用水配制成2 mg/m l溶液,即2 m l/kg,每周1次,共6周,累积总量24 mg/kg;对照组:注射相同体积的注射用水。于末次注射停药后2周,测量体重(BW)、心室质量(VW)、动脉收缩压(ASP)、动脉舒张压(ADP)、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)及左室最大压力上升及下降速度(±dp/dtm ax),并作病理切片观察其组织学变化。结果:与对照组相比,模型组ASP、LVSP、±dp/dtm ax均明显减小,LVEDP明显升高;病理学结果证实符合心肌病样改变。结论:多次间断腹腔注射一定剂量的阿霉素可明显损害心脏的功能,是建立大鼠慢性充血性心力衰竭模型的一种简便可靠的方法。     

热休克蛋白90^ α在血管内皮生长因子165基因治疗大鼠脑梗死中的表达及意义

目的　观察热休克蛋白(HSP)90α在血管内皮生长因子(VEGF)165 基因治疗大鼠脑梗死中的表达,为治疗脑梗死提供实验依据。方法　雌性Wistar大白鼠25 只,体重为250~300 g,随机分为5 组,每组5只。正常对照组(A组)予常规饲养;假手术组(B组)在建立大脑中动脉闭塞(MCAO)模型过程中,仅将栓线插入颈内动脉约1 cm即可;单纯MCAO对照组(C组),采用改进的线栓法制成永久性MCAO模型;空载质粒对照组(D组)在MCAO模型术后,头顶部剃毛,消毒后采用立体定位仪在梗死区相应部位钻一小孔,以5μl空载质粒(pUCCAGGS,20μg/μl),然后缝合切口,精心饲养;治疗组(E组)的方法同D组,注入等量的pUCCAGGS/hVEGF 165取代空载质粒。实验7 d后断头取脑,采用免疫组织化学的方法显示脑中的HSP90α表达情况。结果　A、B两组整个脑部均无HSP90α表达; C、D两组仅有少量表达;E组的半暗带内有明显表达,与C、D组的差异有显著性(P<0.01),半暗带以外区域仅有少量表达或不表达。结论　VEGF165基因可诱导HSP90α在特定部位表达。     

单Lasso指导下肺静脉电隔离治疗阵发性房颤

心房颤动（房颤）为临床上常见的心律失常之一，据Framinhan的研究报告提示，其人群发病率在1％左右，且随着年龄增长其发病率增加。房颤能够引发心力衰竭、血栓栓塞、中风等危险，严重威胁人类健康。1997年以来，消融肺静脉治疗房颤成为一种新的可行的治疗手段。我科于2005年11月20日对2例阵发性心房颤动（paroxysmal atrial fibrillation，PAF）患者成功进行了单Lasso指导下肺静脉电隔离术，取得了很好的效果。报道如下.     

t-PA基因新型真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人组织型纤溶酶原激活因子(tPA)基因的新型真核表达载体,为血栓性疾病的基因治疗奠定基础。方法将tPA基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1MycHisB()中,进行酶切鉴定及DNA测序分析,并将携带有tPA基因的该真核表达载体,通过脂质体介导,转染鼠血管平滑肌细胞,底物发色法测定转基因血管平滑肌细胞tPA活性。结果经双酶切鉴定和测序证实已将tPA基因DNA片段正确插入到真核表达载体中,并能在真核细胞中表达、分泌有活性的tPA。结论成功构建pcDNA3.1MycHisB()/tPA基因新型真核表达载体。     

重组β—半乳糖苷酶腺病毒载体的构建及其在血管闰滑肌细胞中的表达

目的构建表达β-半乳糖苷酶(β-gal)的重组腺病毒,以期为再狭窄的基因治疗研究提供一个对照载 体和为腺病毒介导的基因转移的安全性、可行性、转染效率的研究提供一有用的工具。方法采用基因重组方法构 建穿梭质粒pAd-β-gal,通过同源重组法制备出重组腺病毒Ad-β-gal,转染的293细胞用X-gal染色鉴定Ad-β -gal的正确与否。通过测定260nm的紫外光吸收值估计病毒高度。原代大鼠血管平滑肌细胞采用组织块培养 法。Ad-β-gal以100moi感染VSMCs并行X-gal染色,以观察β-gal在VSMCs中的表达情况。结果成功构建了 pAd-β-gal穿梭质粒和Ad-β-gal重组腺病毒,转染的293细胞和VSMCs经X-gal染为蓝色,病毒浓度为9×l011 pfu/ml,以100moiAd-β-gal转染VSMCs,其转染效率接近l00%。结论表达β-gal的重组腺病毒构建成功,并在 VSMCs中得到有效表达,本研究为将来再狭窄基因治疗研究提供了一对照载体,也为腺病毒介导的基因转移的安 全性、可行性、有效性的研究提供了一有用的工具。     

嵌合性硫代磷酸修饰的反义c—myc寡脱氧核苷酸对动脉平滑？…

目的：血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）迁移在血管成形术后再狭窄的发生中起着关键作用。ｃ－ｍｙｃ是对多种刺激ＳＭＣ迁移的生长因子作出迅速早期反应的基因。推测采用与ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ互补的寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）的反义战略可达到抑制ＳＭＣ迁移的目的。方法：将嵌合性硫代磷酸修饰的反义ｃ－ｍｙｃＯＤＮ通过ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ导入ＳＭＣ后,采用改良的Ｂｏｙｄｅｎ ｃｈａｍｂｅｒ方法检测ＳＭＣ的迁移率。结果：反义ｃ－     

嵌合性硫代磷酸修饰的反义c—myc寡脱氧核苷酸对动脉平滑？…

探讨ｃ－ｍｙｃ基因表达在血管平滑肌细胞增殖信号传导通路中的作用和采用反义ｃ－ｍｙｃ寡脱氧核苷酸抑制血管平滑肌细胞增殖的作用。方法采用对大鼠ｃ－ｍｙｃｍＲＮＡ包括ＡＵＧ在内的释译起始区的前５个密码子的嵌事性硫代修饰的反义ｃ－ｍｙｃ寡脱核氧苷酸,     

重组腺病毒介导的p27Kip1基因治疗大鼠神经胶质瘤的实验研究

目的研究腺病毒介导的人p27Kip1基因(Ad-p27Kip1)对大鼠神经胶质瘤生长的抑制作用。方法建立大鼠胶质瘤模型,随机分成3组:Ad-p27Kip1组、Ad-LacZ和对照组,分别给予Ad-p27Kip1、Lacz重组复制缺陷性腺病毒(Ad-LacZ)和PBS瘤内注射,观察对肿瘤生长的抑制情况,并用免疫荧光法检测p27和细胞周期素(cyclinD1)的表达;原位末端标记法检测细胞凋亡情况。结果Ad-p27Kip1组肿瘤生长受到明显抑制(P<0.05),免疫荧光染色显示移植瘤p27表达明显增强(P<0.05),cyclinD1的表达受到明显抑制(P<0.05),且细胞凋亡显著多于Ad-LacZ组和对照组(P<0.05)。结论Ad-p27Kip1对大鼠胶质瘤的生长具有明显的抑制作用,其机制可能是增强p27表达、抑制cyclinD1表达。p27Kip1有望成为胶质瘤基因治疗的新策略。     

反义c-myc寡脱氧核苷酸对血管平滑肌细胞增殖、迁移和凋亡的影响

为研究硫代磷酸修饰的反义ｃｍｙｃ寡脱氧核苷酸（ＯＤＮ）对血管平滑肌细胞（ＳＭＣ）的增殖、迁移及凋亡的影响。应用脂质体分别介导硫代磷酸修饰的反义ｃｍｙｃＯＤＮ、正义ｃｍｙｃＯＤＮ和错配ｃｍｙｃＯＤＮ进入体外培养的大鼠主动脉ＳＭＣ内，观察其对ＳＭＣ细胞ｃｍｙｃ表达、增殖、迁移和凋亡的影响。结果：①反义ＯＤＮ降低ｃｍｙｃ蛋白的表达。②反义ｃｍｙｃＯＤＮ抑制ＳＭＣ增殖、迁移，并诱导ＳＭＣ凋亡。而正义ＯＤＮ及错配ＯＤＮ则无上述作用。结果提示：应用反义技术抑制ｃｍｙｃ表达在防治经皮腔内冠状动脉成形术（ＰＴＣＡ）术后再狭窄中具有潜在作用。