rAcAP5高表达工程菌株的筛选、多肽的制备、纯化及对栓塞性脑缺血的溶栓作用

犬钩虫抗凝肽5（AcAP5）是一种具有抗凝活性的多肽。本实验室发现重组AcAP5（rAcAP5）具有TAFIa抑制活性,并在体内、体外实验中均具有溶栓活性。本研究拟筛选rAcAP5高表达菌株,并用大鼠栓塞性MCAO模型来评价rAcAP5的溶栓作用。根据大肠杆菌偏爱密码子对编码AcAP5的目的基因进行了优化用具有不同特点的6种表达质粒和11种大肠杆菌菌株构建了66种重组菌株,从中选出rAcAP5可溶性表达量最高的菌株采用阴离子交换色谱和阳离子交换色谱来纯化目的蛋白用高效液相色谱法测定纯化过的rAcAP5的纯度通过飞行质谱测定所表达的rAcAP5的分子量用大鼠栓塞性大脑中动脉阻塞（MCAO）模型评价溶栓作用。rAcAP5表达量最高的菌株是C2566H/pTYB1-rAcAP5,经过两步离子交换层析纯化之后,纯度达到90%,纯蛋白产量为28 mg/L。激光多普勒血流仪测定rCBF评价溶栓效果,给生理盐水（溶媒）后rCBF无明显变化,而给予rAcAP5（50–200μg/kg,i.v.）后,rCBF显著增加,剂量有依赖性,表明rAcAP5具有明显的溶栓作用。综上所述,我们筛选到rAcAP5的高表达菌株,表达、纯化并鉴定了该多肽,发现它在栓塞性MCAO模型上有明显的溶栓作用,提示它有可能作为溶栓剂或辅助溶栓剂应用。     

具有溶栓和脑保护作用的融合蛋白的表达、纯化及活性研究（英文）

为了验证溶栓剂联合神经保护剂治疗可能比单纯溶栓治疗产生更好的治疗效果的假设,通过融合NR6和BH4设计了一种具有溶栓和神经保护双重功能的蛋白质TBN。NR6是通过将两个RGD序列引入溶栓蛋白AcAP5获得的,BH4是抗凋亡蛋白Bcl-xL的关键结构域。编码TBN和NR6的DNA合成后分别克隆到pET30a和pET16b载体中,两种蛋白都在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式表达。NR6带有His标签,通过镍亲和层析纯化,而TBN通过离子交换层析纯化,纯化后的蛋白通过透析使其复性。通过大鼠动静脉旁路模型评价两种蛋白质的溶栓活性,在低剂量(6 nmol/kg)时, NR6和TBN具有一定的降低血栓重量的作用(P<0.05),高剂量(24nmol/kg)时二者可显著降低血栓重量。并且TBN表现出与NR6相同的溶栓作用,表明NR6在融合蛋白TBN中的功能未受影响。通过小鼠血栓栓塞性大脑中动脉堵塞(eMCAO)模型评价两种蛋白质对脑卒中的治疗效果,结果显示TBN降低梗死体积和抑制细胞凋亡的效果优于NR6。通过小鼠尾出血实验评价目的蛋白的出血副作用,结果发现与tPA相比, NR6和TBN的出血时间较短。这些结果证实了我们的假设:溶栓联合神经保护治疗缺血性脑卒中的效果优于单独溶栓治疗。这两个蛋白具有作为新型溶栓候选药进一步开发的潜力。     

B55γ蛋白对t-MCAO模型小鼠中W026B神经保护作用的影响（英文）

W026B是一种新合成的木脂素衍生物,已被证明是一种神经保护剂。已有研究表明:W026B可以在不同的模型中显著减少动物脑梗死体积,改善动物行为学评分,并保护血脑屏障,但其发挥保护作用的确切机制仍不清楚。B55γ蛋白是我们前期通过蛋白质组学筛选而得的W026B作用的目标蛋白之一,本研究探究其对t-MCAO小鼠中W026B保护作用的影响。用siRNA PPP2R2C敲低脑组织中B55γ蛋白的表达,以观察B55γ蛋白对W026B作用的影响。结果表明:敲低B55γ蛋白的表达水平可显著抑制W026B的脑保护作用。进一步研究结果显示:敲低B55γ蛋白的表达消除了W026B降低缺血性脑组织中NF-κB p65水平的作用,同时也逆转了W026B降低缺血性脑组织中caspase-3活性的作用。综上所述,蛋白B55γ可能是W026B发挥脑保护作用的重要调节因子, B55γ可通过影响缺血再灌注过程中的炎症反应和凋亡途径密切参与W026B的脑保护作用。这些结果揭示了W026B的神经保护作用的新机制。     

门冬氨酸钾镁对离体灌流心脏缺氧的保护作用

目的探讨门冬氨酸钾镁对离体心脏缺氧的保护作用,及2种不同制剂组成方式的门冬氨酸钾镁注射液的效能比较。方法将60只SD大鼠取心脏行Langendorff离体心脏灌流,依照灌流液中钾、镁组成的不同分为A制剂组(门冬氨酸钾 门冬氨酸镁)、B制剂组(天门冬氨酸 氧化镁 氢氧化钾)及对照组(KCl MgSO4)3组,每组各20只动物,3组的K 、Mg2 等剂量。记录离体大鼠心脏在缺氧条件下的HR、左室压力变化及心脏跳动持续时间。结果A制剂组中离体心脏在缺氧后HR及左室压力降低速度缓慢,心脏跳动持续时间达(273.9±65.2)min,与B制剂组(174.7±43.6)min及对照组(121.8±32.9)min相比明显延长(P<0.01)。结论门冬氨酸钾镁液对离体缺氧心脏有保护作用,明显延长缺氧状态下心脏的跳动时间,但制剂B比制剂A的抗缺氧效能差。     

小鼠β-防御素2与甲型流感病毒HA1融合基因真核载体的构建与表达

目的：构建小鼠β-防御素2（mBD2）与甲型流感病毒A／PR／8／34（H1N1）血凝素（HA1）基因融合表达的真核载体，并检测其在HEK293细胞中的表达。方法：用PCR技术分别从质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2和peDNA3．1（＋）／HA1中扩增mBD2与HA1基因片段，再用重叠延伸PCR法（overlap-PCR）将HA1与mBD2通过一段多肽接头Gly4Ser融合为mBD2-HA1。将mBD2-HA1融合基因插入真核表达载体pcDNA3．1（＋），经酶切、PCR和测序鉴定正确后，用脂质体转入HEK293细胞，通过免疫荧光检测其瞬时表达。结果：融合基因mBD2-HA1的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／mBD2-HA1构建成功，并在HEK293细胞中成功表达融和蛋白。结论：融合基因mBD2-HA1真核表达载体的成功构建，为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础。     

组氨酸标签人β干扰素在E.coli BL21(DE3)中的表达、纯化和活性测定

目的 在大肠杆菌中高效表达组氨酸标签与人β干扰素融合蛋白,并进行蛋白纯化和生物活性测定.方法 提取人Bel-7402细胞总DNA为模板,经PCR获得人β干扰素编码基因片段.将此基因插入表达载体pET-16b,重组克隆,经酶切与测序确认后转化至大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达和条件优化.表达产物经West...