高效液相色谱法测定大鼠血浆腺苷浓度

腺苷(adenosine,Ado)是一种由心肌细胞、内皮细胞、血小板等释放的内源性嘌呤核苷,主要由ATP降解而来,具有广泛的心血管效应。腺苷具有扩张冠状动脉,增加冠状动脉血流量,改善心肌供氧的作用^[1]。心脏停搏后,血浆组织中腺苷水平明显升高,故腺苷水平对于心肺复苏的预后有一定的评估价值^[2]。本实验利用高效液相色谱——二极管矩阵检测器,建立了一种稳定、灵敏的血浆中腺苷含量的测定方法,具有简便、灵敏度高、特异性强、数据重现性好,测定结果可靠等特点,可为临床诊断和基础研究提供实用的检测方法和可靠的参考数据。     

颈椎旁神经阻滞对颈椎间盘源性疼痛患者外周血细胞因子和T细胞亚群的影响

目的检测颈椎旁神经阻滞治疗前后颈椎间盘源性疼痛患者外周血炎性细胞因子表达水平及T细胞亚群数量。方法选取颈椎间盘源性疼痛住院患者63例,行颈椎旁神经阻滞治疗,在治疗前、治疗后24h、3d、7d检测外周血炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6表达水平及T细胞亚群数量并进行比较。结果相对于治疗前,颈椎旁神经阻滞后24h、3d外周血炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6水平下降;外周血CD3+、CD4+、CD8+细胞数升高。结论颈椎旁神经阻滞治疗可以降低颈椎间盘源性疼痛患者外周血炎性细胞因子的表达,能够影响T细胞亚群的数量从而改善细胞免疫。     

HPLC法测定抗瘤丸中三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Rb1的含量

目的建立以高效液相色谱法测定抗瘤丸中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量的方法。方法色谱柱为Kromasil C18柱（4．6mm×150mm，5um），使用梯度洗脱系统，流动相为乙腈-0．05％磷酸溶液；流速为1．0mL／min；检测波长为203nm；进样量为10μL；柱温为30℃。结果三七皂苷R1的线性范围为82．8～621μg（，=0．9999），平均回收率为100．057％（RSD=0．3996％）；人参皂苷Rg1的线性范围为109．8～823，5μg（，=0．9996），平均回收率为99．248％（RSD=1．0046％）；人参皂苷Rb1的线性范围为112．6～844．5μg（，=0．9999），平均回收率为99．812％（RSD=1．4744％）。结论本方法操作简便、准确，重复性好，可用于抗瘤丸中三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Rb2的含量测定。     

犬骨髓源血管内皮祖细胞体外扩增效能的动态研究

目的:应用离体培养法培养骨髓来源的血管内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells,EPCs)并动态观察扩增效能。方法:2004-04/12在首都医科大学宣武医院外科实验室完成。使用条件培养基和纤维连接蛋白培养骨髓单个核细胞,相差显微镜观察形态变化,测量生长曲线观察增殖能力,检测摄取Dil-ac-LDL的功能,不同时间点行flk-1,CD133和Ⅷ因子的免疫细胞化学检测和CD34,VEG-FR-2及CD133的流式细胞仪检测以定性并观察扩增效率。结果:集落样生长的贴壁细胞平均10d汇合,每毫升骨髓可获得大约(1.3±0.3)×106个细胞,外观鹅卵石样,能摄取Dil-ac-LDL,flk-1,CD133和Ⅷ因子,免疫细胞化学染色均呈阳性,流式细胞仪示VEGFR-2和CD133双阳性细胞扩增达33倍。结论:离体扩增培养法可成功地从骨髓中扩增EPCs,扩增效率能够满足组织工程血管对种子细胞的需要,也为骨髓单个核细胞移植治疗组织缺血提供了间接证据。     

应用原核细胞表达法体外制备基因重组胰岛素降解酶的活性

目的:利用原核细胞表达法体外制备基因重组胰岛素降解酶,并分析其活性。方法:实验于2004-05/11在北京老年医学研究所神经生物研究室完成。将编码大鼠胰岛素降解酶的cDNA插入质粒pGEX-4T-1并转化大肠杆菌BL21,使其表达谷胱甘肽巯基转移酶为标签的融合蛋白质。凝血酶定点分解融合蛋白,用谷胱甘肽-琼脂糖4B亲合层析方法纯化基因重组胰岛素降解酶。重组胰岛素降解酶的活性应用高压液相色谱进行判断。结果:①胰岛素降解酶cDNA编码区片段的亚克隆:重组质粒亚克隆的cDNA片段为3060bp,编码1019个氨基酸。②胰岛素降解酶在原核细胞的表达与纯化:重组质粒pGEX-rIDE在原核细胞中表达为可溶性组分,培养菌液可收获目的基因重组酶约0.5mg/L,纯化的胰岛素降解酶在SDS-PAGE上表现为单一条带,其表观相对分子质量为110000,与野生型酶相同。③基因重组蛋白质对胰岛素的降解作用:牛胰岛素与基因重组蛋白质的洗脱峰分别出现在34.5和38.3min,将纯化的重组蛋白与胰岛素在37℃下共同孵育后,胰岛素含量明显减少。孵育的最初20min质量变化明显,其峰面积值减少了约50%,但其余时间降解不明显。该蛋白质对14-3-3蛋白的两个亚型没有降解作用。结论:基因重组rIDE具有天然酶的活性,但该活性在孵育20min后胰岛素降解延缓,可能是胰岛素的降解产物反馈抑制了rIDE活性,与酶的自身调节有关。本实验制备了具有生物学活性的基因重组型大鼠胰岛素降解酶,为进一步制备抗胰岛素降解酶单克隆抗体以及探讨胰岛素降解酶与2型糖尿病发生之间的关系打下了基础。     

帕金森病患者血清对α-突触核蛋白寡聚体形成的促进作用

目的研究帕金森病(PD)患者血清对外源性α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)寡聚体形成的影响,初步分析血清促进α-Syn寡聚体形成的机制。方法将重组人α-Syn加入PD患者和对照组血清中,37℃振荡孵育,用免疫印迹方法鉴定α-Syn寡聚体的形成情况,用ELISA分析α-Syn寡聚体的形成量。结果α-Syn在血清中振荡孵育后主要形成二聚体和十四聚体。与对照组血清相比较,PD患者血清具有促进α-Syn寡聚体形成的作用。在血清中加入还原性谷胱甘肽可明显减弱PD患者血清促进α-Syn寡聚体形成的作用。结论PD患者血清促进α-Syn寡聚体的形成,其机制可能与α-Syn的氧化修饰有关。     

我院科研型中心实验室的建设与管理

为满足医院科研实验技术的需求,建立以科研为目的 的中心实验室对推动医院的发展十分必要.介绍了我院建立中心实验室的宗旨和特点以及中心实验室实验技术人员、仪器设备、实验室管理规章制度的建设和管理状况,体现了中心实验室作为医院的科研基地对医院科研工作起到了重要作用.     

缺血/再灌注大鼠脑和血浆中α-突触核蛋白含量的变化

目的探讨缺血/再灌注大鼠脑和血浆中α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)含量的变化。方法将30只雄性Wistar大鼠用随机数字表法分成假手术对照组(10只)和缺血/再灌注组(20只)。用线栓法制作大脑中动脉梗阻(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,缺血1.5h后,再恢复灌注24h;用Western blotting法和ELISA法检测大脑缺血半暗带、梗死核心区和血浆中α-Syn的含量变化。结果缺血半暗带α-Syn表达量显著增加,而梗死核心区和血浆中α-Syn无显著性变化。结论缺血/再灌注可增加缺血半暗带中α-Syn的含量。