长爪沙鼠NAFLD模型的建立及其遗传学的研究

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成为目前主要代谢性疾病之一,针对传统的动物模型的缺陷,本研究首次建立了与人类NAFLD(从单纯脂肪肝到脂肪性肝炎,再进展到肝纤维化、肝硬化)极为相似、饲料配方简便的长爪沙鼠NAFLD模型,阐明了长爪沙鼠肝脏脂肪快速沉积的特征,揭示长爪沙鼠脂肪肝易感的分子机制、主要的调控靶点和网络作用特征,为临床治疗及新药研发提供一种背景相对清晰,耗时短的新型脂肪肝动物模型,同时也为NAFLD发病机制及药效新靶点的研究提供实验动物支撑,为选育近交系NAFLD长爪沙鼠奠定了理论与实践基础。     

基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法的建立与评价

目的建立基于高通量测序技术的实验动物沙门氏菌检测方法,应用于实验动物沙门氏菌的检测。方法提取小鼠粪便DNA样本,分别针对16S r DNA区域、23S r DNA区域、16S~23S r DNA IS、23S~5S r DNA IS、gyr B优选区域设计通用引物,对各个引物进行测试分析,优化扩增条件并建库,利用Illumina高通量测序技术检测区分42个样本中的沙门氏菌,评价该方法的特异性和稳定性。结果筛选发现沙门氏菌的菌种分类优选区域为gyr B基因,gyr B基因引物序列为FP5’-AACCACCGCAATCAGACCTT3’,FP5’-AGCCACGAAACCTTCACYA-3’。对引物进行优化,确定最佳扩增条件及样品上样量并正式建库,通过高通量测序和序列分析能检测出42个样品中极微量的沙门氏菌,检测方法稳定,灵敏度高,检测限可达0~102的cfu。结论本实验利用高通量测序技术,建立了一套完整检测实验动物沙门氏菌的生物体系,能检测出实验动物体内极微量的沙门氏菌,检测方法稳定性好,灵敏度高,可沿用至其他种类病原微生物的检测。     

线粒体-细胞色素C途径在兔非酒精性脂肪肝肝细胞凋亡中的作用

目的探讨线粒体-细胞色素C途径在兔非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)肝细胞凋亡中的作用。方法雄性日本大耳兔40只,随机分为正常对照组(8周)和NAFLD模型组(4、6、8周组),每组各10只。模型组按1.2 m L/kg皮下注射花生油,2次/周,建立日本大耳兔NAFLD模型。按各组时间点处死兔子,测定兔血清中生化指标水平;HE染色观察肝组织病理形态改变,流式细胞仪检测肝细胞凋亡率;提取肝脏线粒体,分光光度法检测线粒体通透转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)的状态变化;免疫组织化学法检查Bcl-2、Bax、细胞色素C和caspase-3在肝组织中的表达情况;Western blot检测细胞色素C以及caspase-3含量变化。结果与正常对照组相比,模型组肝脏脂质代谢指标和相关炎症因子表达水平升高,模型组肝细胞凋亡率与对照组比较显著增加(P0.01)。造模4周时出现肝功能损伤,脂质代谢紊乱,随着NAFLD病程的发展,Bcl-2、Bax、细胞色素C和caspase-3表达量逐渐增加,线粒体通透转换孔开放率随高脂饮食饲养时间延长明显增加(P0.01)。结论线粒体-细胞色素C途径在NAFLD引起的肝细胞凋亡中起到了一定的调控作用。     

杨梅核醇提取物体外抗氧化活性研究

目的:研究杨梅核提取物酚性物质含量及抗氧化活性。方法:在测定杨梅核不同乙醇浓度提取物中酚性物质含量的基础上,采用分光光度法,测定该提取物对DPPH、脂质过氧化的清除能力和总还原力,并通过多元线性回归分析,考察了其体外抗氧化活性及酚性物质含量的相关性。结果:杨梅核不同乙醇浓度提取物均具有显著的抗氧化活性,且自由基清除率与各提取物中总黄酮含量呈正相关。结论:黄酮类化合物可能是其抗氧化作用的主要物质基础。     

杨梅核仁油的GC-MS分析

目的:明确杨梅核仁油的化学组成。方法:采用索式抽提法提取杨梅核仁油,分析其理化指标;并采用GC-MS法,对杨梅核脂肪酸成分进行了系统分析。结果:杨梅核仁得油率为21.54%;杨梅核仁油经GC-MS分析共检测出11种脂肪酸,其中亚油酸含量达40.86%,不饱和脂肪酸(亚油酸、8,11-十八碳二烯酸和9,12,15-十八碳三烯酸)含量占总量的80%左右。结论:杨梅核仁油具有较高的营养价值,是一种品质优良的油脂。     

冬凌草甲素聚乙二醇功能化氧化石墨烯纳米粒的制备及抗结肠癌实验研究

目的制备负载冬凌草甲素(oridonin,ORI)的聚乙二醇功能化氧化石墨烯(PEGylated graphene oxide,GO-PEG)纳米粒(nanoparticles,NPs),并探讨其对结肠癌的抑制作用。方法利用酰胺化反应将端基为氨基的四臂聚乙二醇(PEG)连到氧化石墨烯(GO)上,并通过红外光谱(IR)和差示-热重联用热分析仪(TGA)等对其进行表征;再通过物理共混的方法在GO-PEG上负载抗肿瘤药物ORI,紫外光谱(UV)法测其包封率和载药率,MTT法测定载药体系对人结肠癌细胞SW620和HT29的增殖毒性,并建立荷瘤裸鼠模型考察其体内抗肿瘤活性。结果 IR和TGA测定结果表明PEG已成功偶联到GO上,UV法测得ORI-GO-PEG的包封率和载药率分别为95.81%和48.92%,且在各种生理溶液中具有良好的稳定性。体外细胞毒性实验结果表明,与ORI裸药相比,ORI-GO-PEG-NPs对结肠癌细胞的杀伤能力更强。体内抑瘤实验进一步发现,ORI-GO-PEG-NPs可以更好地抑制体内SW620肿瘤的生长。结论制得的ORI-GO-PEG-NPs具有优良的载药性能和较强的抗结肠癌作用,为今后开发抗肿瘤药物纳米给药系统提供了实验依据。     

基于肺部苦味受体抗哮喘天然活性成分筛选模型的建立与应用

目的构建以肺部苦味受体TAS2R14为靶点的高通量筛选细胞模型,为寻找高效、低毒的新型抗哮喘天然药物奠定基础。方法利用同源重组技术将TAS2R14受体基因插入p LVX-basic质粒,构建p LVX-Ac GFP1-N1-TAS2R14重组载体,并将其转染入HEK293T细胞,建立特异性高表达TAS2R14受体基因的细胞株。利用该细胞模型对120种苦味中药提取物和单体化合物进行高通量筛选。结果建立的模型Z′因子为0.69和0.66,筛选发现陈皮提取物及其药效物质柠檬苦素,白果提取物及其药效物质芦丁、奎宁对TAS2R14受体具有显著的激动作用。结论建立的TAS2R14受体激动剂高通量筛选模型稳定性好、灵敏度高,筛选得到的3种中药单体具有潜在的TAS2R14受体激动活性。     

槲皮素对大鼠非酒精性脂肪肝炎的治疗作用及其机制

目的 观察槲皮素对大鼠非酒精性脂肪肝炎(NASH)的治疗作用,以及槲皮素对NASH大鼠肝组织核因子-κB (NF-κB)及其下游转录因子表达水平的影响.方法 采用高脂饲料喂食6周,建立NASH大鼠模型.灌胃给予40～160 mg/kg槲皮素治疗4周.采用生化检测仪检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平.采用Western blotting法检测各组肝脏中NF-κB蛋白表达情况.采用RT-PCR技术检测各组肝脏中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素1β(IL-1β) mRNA的表达情况.结果 与高脂模型组相比,槲皮素各剂量组大鼠血清LDL-C、TC、AST水平显著降低.病理组织学检查结果表明,给予槲皮素治疗后,可明显减轻NASH大鼠肝脏脂肪变性和炎性细胞浸润;同时,还可明显降低TNF-o、IL-6和IL-1β mRNA以及NF-κBp65蛋白的表达,并呈一定的量效关系.结论 槲皮素对高脂饮食诱导大鼠NASH有明显治疗作用,作用机制可能与其抑制肝细胞脂质沉积和调控NF-κB通路有关.     

橙黄胡椒酰胺酯对脂多糖诱导人肺泡上皮细胞A549凋亡的抑制作用

目的 探讨橙黄胡椒酰胺酯(AA)对脂多糖(LPS)诱导人肺泡上皮细胞A549凋亡的抑制作用及其转录组学调控机制.方法 采用MTT法检测经LPS及AA处理后A549细胞的增殖情况.采用流式细胞技术检测细胞凋亡率.采用RNA-seq技术筛选AA处理前后A549细胞的差异表达基因,并将得到的差异表达基因进行GO功能富集以及KEGG通路分析.结果 10μg/mL LPS可诱导A549细胞发生明显凋亡,凋亡率为(51.7±3.2)％,与正常组凋亡率[(4.8±0.2)％]相比差异有统计学意义(t=0.000,P＜0.05);给予15～60μg/mL AA干预后,可明显抑制LPS诱导的细胞凋亡,并呈一定的浓度依赖性.通过比较分析,共筛选出差异表达基因76个,其中显著下调的基因为9个,显著上调的基因为67个;依据作用通路分类,显著通路(P＜10-3)的有2个,分别是细胞外基质受体互作通路和肿瘤坏死因子(TNF)信号通路.结论 AA可抑制LPS诱导的A549细胞凋亡,其作用机制可能与细胞炎症及黏附等的调控有关.     

克白颗粒抗白癜风的体内外药效研究

目的 研究克白颗粒抗白癜风的体内外药效,并对克白颗粒进行安全性评价。方法 采用血清药理学实验方法检测克白颗粒含药血清对小鼠黑色素瘤细胞B16f10增殖能力的影响;选取50只健康豚鼠随机分成正常对照组、模型对照组及克白颗粒高、中、低剂量(9.04,4.52,2.26 g·kg^-1·d^-1)组,每组10只,除正常对照组外,其余各组采用化学脱色法连续涂抹7%H₂O₂ 50 d,制备实验性白癜风豚鼠模型,肉眼观察各给药组对实验性白癜风豚鼠模型的疗效,检测豚鼠血液中酪氨酸酶(TRY)、胆碱酯酶(CHE)、单胺氧化酶(MAO)、丙二醛(MDA)的含量;长期毒性实验对克白颗粒进行安全性评价。结果 血清药理学实验表明克白颗粒含药血清能够显著促进B16f10细胞的体外增殖。造模后,模型组豚鼠血清MDA、MAO含量显著升高(P<0.05),CHE、TRY含量显著降低(P<0.05或0.01);与模型对照组比较,克白颗粒高剂量显著降低血清中MDA含量(P<0.01),高、中剂量显著降低MAO的含量(P<0.05)、显著升高CHE的含量(P<0.05),但对TRY含量无显著影响。长期毒性实验结果显示克白颗粒对SD大鼠脏器重量无显著影响。结论 克白颗粒显示出良好的抗白癜风效果,其作用机制可能与调节血液中CHE、MAO、MDA含量、促进黑色素细胞增殖有关。