不同分化程度胃癌组织中hMSH2 mRNA的表达

目的 :研究正常胃粘膜和不同分化程度胃癌胃粘膜组织中hMSH2mRNA的表达。方法 :应用原位杂交技术 ,对 2 7例胃癌 (高、中、低分化分别为 5例 ,9例与 13例 )和 19例正常胃粘膜组织中hMSH2mRNA表达进行检测。结果 :癌组织中杂交信号阳性细胞数与正常组织相比显著减少 (P <0 0 5 )。低分化胃癌 (2 1.8± 10 .6 )与中分化胃癌 (5 0 .9± 19.3)及高分化胃癌 (72 .5± 2 3.3)相比差异显著 (P <0 .0 1)。结论 :hMSH2mRNA表达与胃癌分化程度有关 ,胃癌细胞的分化程度愈低 ,其hMSH2mRNA表达愈低。hMSH2可能对胃癌细胞存在分化诱导或转录水平调控     

人胃癌细胞系BGC-823的遗传不稳定性

目的 :研究人胃癌BGC 82 3细胞系的遗传不稳定性。方法 :应用染色体G 分带、核型分析和PCR及银染技术。结果 :BGC 82 3细胞系染色体众数为亚三倍体。规律性出现 3个标记染色体 ,1号染色体短臂部分缺失。部分核型出现双微小体。微卫星位点D9s171为纯合性缺失 ,D9s16 0 4为杂合性缺失。结论 :BGC 82 3细胞系在染色体水平和DNA水平均表现遗传不稳定性     

胃癌组织中核基质蛋白与P16基因上游序列结合检测

目的 :研究胃癌组织核基质蛋白与p1 6基因上游序列的结合情况及其意义。方法 :采用Southwestern印迹技术及Genetools定量分析软件 ,对 2 2例胃癌及相应正常组织的核基质蛋白与P1 6基因上游序列的结合进行了检测。结果 :正常胃组织核基质蛋白与p1 6基因上游序列结合主带的相对分子质量 (Mr)为 2 80 0 0、30 0 0 0、4 0 0 0 0、4 30 0 0、5 0 0 0 0 ,胃癌组织中为 4 0 0 0 0、6 6 0 0 0。与正常胃组织比较 ,胃癌组织中核基质蛋白与P1 6基因上游序列结合的6 0 0 0主带阳性信号明显增强 (P <0 .0 5 ) ;而不同分化程度及不同临床分期胃癌组织间 ,此主带阳性信号强度差异无统计学意义 (P >0 .0 5 )。结论 :胃癌组织中 6 6 0 0 0蛋白与p1 6基因上游区结合量的异常可能是胃癌发生的早期分子事件。     

端粒酶逆转录酶及c-myc基因反义寡核苷酸对HL-60细胞端粒酶活性的影响

目的研究端粒酶逆转录酶（hTERT）与c-myc基因反义寡核苷酸（ASODN）对HL-60细胞端粒酶活性的影响,探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT和c-myc基因表达的关系。方法应用反义寡核苷酸（ASODN）分别封闭HL-60细胞hTRET与c-myc基因,RT-PCR方法检测基因表达;分别使用TRAP-ELISA法、PAGE-银染法检测细胞端粒酶活性。结果ASODN作用细胞72h后。hTERT、c-mycmRNA的表达受到不同程度抑制。以30μmol／L作用组表达量最低。TRAP-ELISA检测：hTERT ASODN10、20、30μmol／L作用组,c-myc ASODN20、30μmol／L作用组与未作用组比较,端粒酶活性明显降低（P〈0．05）;c-myc ASODN 10μmol／L作用组及c-myc、hTERTSODN作用组与未作用组比较无显著差异（P〉0．05）。PCR-PAGE检测：hTERT与c-myc ASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmol／L作用组条带最少,而同浓度hTERT ASODN作用组较c-mycASODN作用组条带减少。结论hTERT与c-myc基因ASODN能够分别抑制该基因mRNA的表达,同时具有下调端粒酶活性作用。     

hTERT反义寡核苷酸对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用

为了研究hTERT基因反义寡核苷酸(ASODN)对HL-60细胞增殖及端粒酶活性的抑制作用,并探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT基因表达的关系,应用反义寡核苷酸封闭HL-60细胞hTERT基因的表达,RT-PCR方法检测该基因表达抑制情况,倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖状态,应用TRAP-ELISA、TRAP-PAGE方法检测HL-60细胞端粒酶活性。结果发现反义硫代寡核苷酸作用于HL-60细胞72小时后,hTERT基因表达明显受抑,细胞生长受抑,增殖能力减弱,其抑制作用具有序列特异性及浓度、时间依赖性。端粒酶活性检测显示反义寡核苷酸10、20和30μmol/L作用组OD450-690值分别为1.504±0.47、1.223±0.39,0.944±0.16,与未作用组(2.648±0.42)比较,差异有显著性(P<0.05);正义寡核苷酸20μmol/L作用组(OD450-690值为2.376±0·65)与未作用组比较,差异无显著性(P>0.05)。TRAP-PAGE检测表明hTERTASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmol/L作用组条带最少。结论hTERT基因反义寡核苷酸能够通过封闭hTERT基因的表达而抑制HL-60细胞增殖,下调端粒酶活性。     

shRNAs对胃癌细胞系BGC-823胃泌素表达的抑制效应

目的 研究shRNAs对胃癌细胞系BGC-823胃泌素表达的抑制效应.方法 设计4条针对胃泌素基因不同位点的寡核苷酸序列,通过体外转录法合成相应的shRNAs.以10nmol/L、20nmol/L、40nmol/L和80nmol/L的终浓度,将4条shRNAs分别转染胃癌细胞BGC-823.应用原位杂交及免疫细胞化学方法检测胃泌素表达的抑制效果,筛选最有效的shRNA.应用RT-PCR进一步验证其对胃泌素mRNA的抑制效应.应用MTT法检测4条shRNAs在不同浓度下对BGC-823细胞的增殖抑制效应.结果 转染后24h、48h及72h,胃泌素表达均被明显地抑制,并呈现浓度及时间依赖的趋势.shRNA3转染后72h,mRNA及蛋白水平表现出最佳的抑制效率,分别为(54.27±0.042)%和(41.69±0.038)%.RT-PCR结果显示,shRNA3对BGC-823细胞胃泌素mRNA的抑制率为48.1%.MTT结果显示,除shRNA4处理组外,其余3组处理细胞均表现出浓度依赖性的增殖抑制趋势.结论 4条shRNAs在mRNA及蛋白水平均明显地抑制了胃癌细胞BGC-823胃泌素的表达,shRNA3可能为最有效的胃泌素-shRNA.shRNA对胃泌素表达的抑制,显著降低了BGC-823细胞增殖能力.     

葡萄糖神经酰胺合成酶siRNA表达载体的构建

目的:构建针对葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)mRNA的siRNA表达载体,并观察其对转染细胞中GCS表达的影响.方法:根据人GCS mRNA编码序列,设计并合成3对针对GCS的发卡状RNA的寡核苷酸,各64个碱基,退火后插入pSUPER EGFP载体重组构建RNAi质粒,进行双酶切及测序鉴定.重组质粒用脂质体包裹转染入SGC7901/VCR细胞,采用RT-PCR检测GCS mRNA表达水平的变化.结果:重组构建的载体经酶切鉴定与测序分析,显示特定位点靶序列与设计序列完全一致.转染SGC7901/VCR细胞后,GCS mRNA表达明显降低.结论:GCSsiRNA表达载体构建成功,并可有效抑制人胃癌耐药SGC7901/VCR细胞中GCS的表达,为后续研究及肿瘤的基因治疗奠定了基础.     

食管癌组织hMSH2 mRNA的表达和启动子区甲基化

目的:检测食管癌组织中hMSH2 mRNA的表达和启动子区甲基化异常. 方法:食管癌标本及相应正常食管黏膜组织32例. 原位杂交法检测hMSH2 mRNA的表达,甲基化特异PCR(MSP)法检测错配修复基因hMSH2启动子区甲基化. 结果:食管癌组织中hMSH2 mRNA阳性表达率为46.9%,正常组织为84.4%(P＜0.05). hMSH2 mRNA阳性表达率与食管癌患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、病理类型、组织学分级、淋巴结转移、浸润深度等均无关(P＞0.05). 食管癌组织中hMSH2启动子区甲基化发生率为34.4%,正常食管黏膜组织未发现甲基化,2组甲基化阳性率相比较差异有统计学意义(P＜0.01);高龄患者(≥70岁)癌组织中hMSH2启动子区甲基化发生率(85.7%)明显高于较低龄患者(＜70岁)(20.0%)(P＜0.05);病理组织学Ⅲ,Ⅳ级食管癌组织中hMSH2启动子区甲基化发生率(70.0%)高于Ⅰ,Ⅱ级(18.2%)(P＜0.05). 食管癌组织中hMSH2 mRNA阳性组启动子区甲基化的发生率(13.3%)低于hMSH2 mRNA表达阴性组(53.0%)(P＜0.05). 结论:hMSH2的表达缺失是食管癌发生的早期事件;食管癌组织中hMSH2基因启动子区甲基化与患者年龄和肿瘤病理类型可能有关;hMSH2基因的失活与其甲基化有一定关系.     

白血病细胞核基质蛋白的研究

目的　研究白血病细胞核基质蛋白与正常骨髓细胞核基质蛋白的差异。方法　应用高盐抽提法抽提细胞核基质蛋白,SDS PAGE技术分析白血病细胞与正常骨髓细胞核基质蛋白的变化。结果　与正常骨髓细胞相比,急性白血病细胞核基质蛋白成分明显增加,且出现多种正常骨髓细胞所没有的蛋白带;不同类型白血病细胞核基质蛋白存在差异。结论　白血病细胞与正常骨髓细胞的核基质蛋白成分有明显差异,新出现的核基质蛋白改变可能与白血病的发生发展有关。     

聚丙烯酰胺凝胶银染技术改良

目的 :对变性及非变性聚丙烯酰胺凝胶银染方法最适条件进行探讨和改良。方法 :采用PCR 聚丙烯酰胺电泳、硝酸银染色检测 15 9～ 196bp及 336bpDNA片段 ,并对不同显影液浓度与显色温度下的结果进行比较。结果 :DNA分子经改良银染法检测均清晰可见 ,对比良好。结论 :聚丙烯酰胺凝胶电泳后采用银染技术分析 ,方便快捷 ,易长期保存 ,并减小了对人及环境的毒害作用