用16S rRNA探针定量测定普氏立克次体在细胞内的 …

目的 以普氏立克次体为研究对象，建立一种定量测定胞内微生物敏感的方法。方法 从立克次体感染细胞提取总ＲＮＡ为样品或用硫氰酸胍裂解感染细胞，以裂解物为样品，用＾３２Ｐ标记的１６Ｓ ｒＲＮＡ特异探针做ＥＮＡ酶保护分析。根据探针分子结合数，计算出检测到的靶序列分子数，反映细胞内微生物的繁殖量。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组的初步注释

目的 对已完成测序的铜绿假单胞菌噬菌体PaP3基因组进行初步注释。方法 利用生物信息学软件和网上工具对噬菌体PaP3进行开发阅读框（Open reading frame,ORFs）检索；编码序列鉴定；对公共数据库进行BLAST查询，分析基因的可能功能；对存在高度同源性序列的推定蛋白进行多重序列比对和系统发生树分析。结果 利用生物信息学软件在PaP3基因组中检索到252个大于100bp的ORFs，其中有699个ORFs可确认为推定基因；核苷酸对核苷酸的BLASTn分析未发现有意义的同源性核苷酸序列；核苷酸对蛋白质的BLASTx分析共发现了4个在公共数据库中有高度同源性序列的ORFs，根据其同源性蛋白的功能推定ORF13052－14761编码产物为引物酶／解旋酶，ORF40280－41728编码产物为末端酶大亚单位，ORF41728－42225编码产物为溶菌酶，ORF16912－18549编码产物为DNA聚合酶；绘制出了上述这四种蛋白的系统发生树。结论 噬菌体PaP3具有252个大于100bp的ORFs，其中69个为推定基因，有4个推定基因的功能被确认为分别编码引物酶／解旋酶，末端酶大亚单位，溶菌酶及DNA聚合酶。     

临床医学八年制《医学微生物学》教学探讨

医学微生物学是基础医学的重要组成部分,也是联系基础与临床的桥梁课程,它与疾病的诊断、治疗和预防密切相关。随着生命科学的不断发展,医学微生物学所涵盖的内容越来越丰富,涉及的领域越来越宽泛。这就要求医学专业学生在掌握这门课程基础知识的同时,学会灵活运用,举一反三。然而,由于医学微生物学课程本身具有知识点多而散、难记忆、易混淆等特点,因此,传统的以课本为主体,老师为中心的教学方法不能够很好的激发学生的学习兴趣和创造力,也不利于实现现代医学教育培养实用型、创新型综合性医学人才的目标［1］。     

单克隆抗体亲和层析纯化绿脓杆菌外毒素A

本文采用ELISA法测定了本室研制的4株单抗的相对亲和力。当包被抗原浓度选定为5μg/ml后,饱和50％这一抗原浓度所需的抗体蛋白质量是:14F10为0.015μg/ml,23B9为0.010μg/ml,24B5为0.4μg/ml,23C12为2.5μg/ml。故它们的相对亲和力是:23B9>14F10>24B5>23C12。 选用23B9与CNBr一活化的Sepharose4B按说明书条件进行偶联,制备免疫吸附柱。将预处理的DE-52离子交换纤维素投入绿脓杆菌标准产毒株PA-103株培养物上     

绿脓杆菌外毒素A的Ⅰ Ⅱ区基因的克隆与表达

绿脓杆菌外表素Ａ是由６１３个氨基酸残基组成的单链杀细胞毒素；利用ＰＣＲ技术直接从绿脓杆菌染色体ＤＮＡ中扩增了外毒素Ａ的Ⅰ＋Ⅱ区的结构基因，通过酶切鉴定、ＤＮＡ序列分析，证实了克隆的基因片段为外毒素Ａ的结构基因；重组表达质粒经诱导表达后ＳＤＳ－ｐＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实了表达的产物为外毒素Ａ分子。对外毒素Ａ的Ⅰ＋Ⅱ区结构基因的克隆表达为疫苗研制、毒素类似物的制备以及导向药物的构建打下了基础。     

单克隆抗体在研究绿脓杆菌表面抗原中的应用

McAb与各种免疫化学技术结合,用于分析细胞表面抗原。在交叉免疫电泳中,应用两种不同脂多糖特异的McAb,揭示了在一株绿脓杆菌内存在LPS亚群。为确定微孔蛋白F的表面位置,这种蛋白特异性的四株McAb都显示出能与完整绿脓杆菌细胞作用,在间接免疫荧光试验中产生高强度荧光。在小鼠中,一种F蛋白特异的McAb成功地显示了对绿脓杆菌感染的保护,表明F蛋白是能在活菌内表达的。采用免疫荧光,显示脂蛋白H_2书异的McAb只是在O抗原缺陷的绿脓杆菌变株中能与该蛋白作用。蛋白F特异性McAb能与溴化氰裂解或胰酶及链酶蛋白酶消化的F蛋白片段反应,这充分证明McAb在抗原分析中可用作特异性试剂。根据肽段分析,可测定F蛋白独特抗原决定区域的化学性。     

单克隆抗体亲和层析纯化绿脓杆菌外毒素A

本文用间接ELISA法测定了本室研制的4株绿脓杆菌外毒素A单克隆抗体的相对亲和力。结果表明,它们的相对亲和力可排列为23B9>14F10>24B5>23C12。选用23B9制备免疫吸附柱,用于亲和层析纯化绿脓杆菌外毒素A。洗脱液用pH11.5,0.05 mol的二乙胺溶液,回收率为上柱样品的72.4％。所获纯化毒素对BALB/c小鼠的LD50为137ng,在SDS聚丙烯酰胺凝胶电冰中为一条带,保持有良好的毒性及免疫学活性。     

IFN-β基因启动子调控区域的分析及IRF-3报告基因的构建

目的对IRF-3的主要靶基因--小鼠IFN-β基因启动子区域进行分析并构建IRF-3报告基因载体.方法将小鼠IFN-β基因启动子全序列以及不同截短片段克隆到无启动子的pGF3basic/enhancer质粒中,以EGFP为报告基因,转染小鼠Raw264.7巨噬细胞系后观察细胞对LPS刺激的反应.结果IFN-β启动子PRD调控区域上游序列、PRDⅠ区,PRDⅡ区和PRDⅣ区缺失后,LPS同样能诱导EGFP报告基因的表达.只保留PRD区及IFN-β启动子核心区的载体转染Raw264.7细胞后,可以在LPS刺激下诱导EGFP报告基因的高表达.结论构建了能检测IRF-3活性的报告基因载体,为进一步研究LPS激活IRF-3的信号转导通路奠定了基础.     

重组毕赤酵母高密度发酵表达肽抗生素hPAB-β及其抑菌活性初步鉴定

目的探讨hPAB-β工程菌的高密度发酵方法,鉴定发酵产物中目的肽的活性。方法采用补料分批培养方法,在3.7 L发酵罐中对重组酵母菌进行高密度发酵,温度控制在30℃,pH值范围为4.95～5.05,在菌体湿重达到200～250 g/L后开始诱导,经过约50 h甲醇诱导后结束发酵。对发酵上清进行反相层析、分子筛层析以及反相高效液相色谱纯化,通过抑菌实验对纯化产物进行活性鉴定。结果3次高密度发酵在菌体湿重分别达到235.0 g/L、210 g/L和264.8g/L时进行诱导表达,发酵上清中目标肽的表达量分别达73.7 mg/L、76.6 mg/L和74.3 mg/L。发酵上清通过反相层析、分子筛层析以及反相高效液相色谱纯化,获得重组肽抗生素hPAB-β,该重组蛋白经抑菌实验显示了较好的抑菌活性。结论成功实现了酵母工程菌的高密度发酵,为下一步规模化制备hPAB-β奠定了基础。