人肽抗生素hPAB-β多拷贝串联基因工程菌的筛选及发酵研究

目的：对已构建的人肽抗生素hPAB-β 1～8拷贝串联基因工程菌进行筛选，并对其优势菌株进行发酵研究，为hPAB-β的规模生产奠定基础。方法：对1～8拷贝串联基因工程菌的目标蛋白表达率进行比较后，选择2～5拷贝菌进行菌产量、目标蛋白表达率、包涵体溶解性、亲和层析效果比较，确定最佳多拷贝菌；对其摇瓶条件下发酵的培养液、温度、气体条件、IPTG诱导时机、浓度及时间进行研究。结果：在相同条件下，3拷贝菌产量(3．153g／L)最高，目标蛋白表达率(27．8％)接近最高水平，包涵体能溶解完全；利用亲和层析能成功捕获融合蛋白，后者经羟胺裂解，可获得相对分子质量与合成hPAB-β成熟肽大小相符的小肽，筛选出的优势菌传代稳定，其最佳摇瓶发酵条件为37℃，160r／min条件下，在改良M9-cAA培养液中培养至吸光值(A600)≈2．5时，以终浓度为100μmol／L的IPTG诱导表达5h。结论：确定了3拷贝菌为最佳多拷贝菌，并确定了其最佳摇瓶发酵参数。     

嗜酸乳杆菌推定的β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中的功能性表达

目的在大肠杆菌中诱导表达以嗜酸乳杆菌克隆β-半乳糖苷酶基因lacZ,为研究其酶学特性做准备。方法从嗜酸乳杆菌ATCC4356中克隆lacZ基因,并构建表达载体pET22b—lacZ-H、pQE31-H-lacZ和pQE31-lacZ,然后在大肠杆菌中诱导表达,并测定表达产物的β-半乳糖苷酶活性。结果无标签的重组嗜酸乳杆菌β-半乳糖苷酶LacZ获得了功能性表达,表达量可达2．28kU／L．而融合His-Tag的重组嗜酸乳杆菌LacZ却失去了β-半乳糖苷酶活性,即使复性也不能恢复。结论克隆表达的成功为该酶的酶学性质研究和可能的应用打下了基础。     

噬菌体PaP3多糖解聚酶对铜绿假单胞菌生物膜的作用研究

目的 检测重组铜绿假单胞菌噬菌体PaP3多糖解聚酶对铜绿假单胞菌生物膜的降解活性.方法 经FTTCConA/PI荧光双染色后,采用激光扫描共聚焦显微镜观察重组多糖解聚酶处理前后PA3生物膜的形态变化,以测定多糖解聚酶对生物膜的降解活性;测定多糖解聚酶作用前、后铜绿假单胞菌对4种敏感抗生素(乳酸环丙沙星、加替沙星、头孢他啶、硫酸庆大霉素)的MIC、MBC变化情况,从而判断多糖解聚酶对抗生素的协同杀菌作用.结果 FTTC-ConA/PI荧光双染色结果显示.经重组多糖解聚酶处理后,铜绿假单胞菌生物膜的胞外多糖组分少而分散,包裹在胞外多糖组分里的细菌数量也大大减少,表明多糖解聚酶确实能够特异性的降解生物膜的胞外多糖组分.多糖解聚酶作用后四种抗生素相应的MIC、MBC都出现了不同程度的降低,其中以头孢他啶降低最为明显,表明多糖解聚酶对抗生素具有协同杀菌活性.结论 重组噬菌体PaP3多糖解聚酶在体外可以特异性的降解铜绿假单胞菌生物膜的胞外多糖,有利于抗生素通透生物膜,作用于菌体,具有协同抗菌作用.     

猪链球菌2型疫苗候选分子FBP的表达及免疫学活性研究

目的 表达SS2纤连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding protein,FBP),研究其免疫学活性,探讨其保护活性和作为疫苗候选分子的可能性.方法 用PCR技术从SS2临床分离株05ZYH33的基因组DNA中扩增出fbp基因片段,插入表达载体pET-30b( )中,构建重组表达载体pET30b-fbp.该载体经酶切鉴定和DNA测序鉴定后,转化E.coli.Rosetta,IPIG诱导表达,镍离子亲和层析纯化重组蛋白.Western blot证实目的蛋白的分子量和免疫反应原性.重组蛋白免疫小鼠后收集多抗血清,间接ELISA检测其效价.结果 PCR扩增的fbp基因长度约为1700 bp,所构建重组表达载体酶切鉴定无误、测序证实碱基序列100%正确且保持正确读框.IPIG诱导表达,目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的10%.亲和层析获得目的蛋白,纯度达80%以上.Western blot检测证实该蛋白能与感染SS2的病人血清发生阳性反应.重组蛋白免疫小鼠后血清效价达1:25600以上.结论 成功构建了表达载体pET30b-fbp,可在工程菌E.coli.Rosetta中表达;表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性.     

天然抵抗力相关巨噬细胞蛋白研究进展

天然抵抗力相关巨噬细胞蛋白家族是一类离子转运蛋白,存在于多种生物细胞中.在哺乳动物中它与机体对巨噬细胞内寄生病原体的抵抗力密切相关.本文对该蛋白的分子生物学和功能方面的研究进展作一综述.     

人源肽抗生素hPAB-β突变体及其重组杆状病毒的构建

确定人工合成的人肽抗生素hPAB-β的抗菌活性。利用已知肽抗生素hBD-2的晶体结构坐标进行hPAB-β的同源模建,设计hPAB-β突变体,用PCR法生成hPAB-β突变体基因,分别构建转移载体和重组杆状病毒,结果表明,合成肽hPAB-β在正确复性后具有较好的杀菌活性,将4种突变体基因插入转移体pFAST HTa,筛选阳性重组子pFAST-hPAB-β并转化DH10Bac大肠杆菌,获得了重组杆状病毒,为筛选活性强而结构更为简单的hPAB-β突变体奠定了基础。     

重组人肽抗生素hPAB-β及其突变体的活性测定与筛选

目的 测定重组人肽抗生素hPAB—β及其突变体的抗菌活性，筛选理想的活性分子。方法 应用平板法和MIC测定法检测重组表达的hPAB—β及突变体hPAB—β38、hPAB—β34对8株实验室保存菌株及10株临床分离菌株的杀菌能力。并以化学合成的肽抗生素hPAB—β作对照；根据各目的分子抗菌能力的强弱，筛选理想的目标分子，并分析突变体结构的变化对其功能的影响。结果 重组hPAB—β及突变体hPAB—β38与化学合成的天然分子抗菌活性相当．对革兰氏阳性菌的MIC在125～250μg／ml之间，对革兰氏阴性菌的MIC在31～125μg／ml范围内；突变体hPAB—β34活性下降4倍左右；结构分析表明hPAB—β38与hPAB—β参与二级结构中α螺旋和β片层构成的氨基酸残基完全相同，而hPAB-β34则有显著不同，α螺旋少了2个残基，3个β片层中除β2与hPAB—β相同外，β1和β3的构成均多2个残基，推测hPAB—β34二级结构的改变是其活性降低的主要原因。结论 重组肽抗生素hPAB—β具有抗菌活性，删除3个端残基的突变体hPAB—β38活性不变，可作为hPAB—β走向临床应用的一个新侯选者。     

铜绿假单胞菌噬菌体PaP1内溶素基因克隆、表达及活性分析

目的 构建铜绿假单胞菌噬菌体内溶素重组原核表达载体,检测重组蛋白的酶学活性及抑菌活性.方法 利用重组技术将铜绿假单胞菌裂解性噬菌体PaP1内溶素基因构建到表达载体pQE31中,并在大肠杆菌M15(pREP4)中诱导表达,通过非变性方法纯化重组融合蛋白,利用酶潜电泳、抑菌实验等技术检测酶学活性及抑菌活性.结果 酶谱电泳方法结果显示重组融合蛋白对铜绿假单胞菌细胞壁肽聚糖有降解作用,抑菌活性检测结果显示重组融合蛋白对金黄色葡萄球菌有一定的抑菌效果.结论 该研究从实验方面证实了噬菌体PaP1内溶素基因的生物学功能.     

铜绿假单胞菌的细胞间信号联系及其在感染中的作用

细菌的生物学特性往往是群体行为的结果。细菌能够感知它们所处的环境，并通过对自身细胞密度的感应来进行相互间联系，对信息进行加工处理进而做出适当的反应，这种被称为群体感应（quorum—sensing）或细胞间信号（cell—to—cell signaling）的生命现象普遍存在于多种革兰阴性菌和革兰阳性菌中。尽管这种现象早在1970年就已在海生费氏弧菌中被发现，但是直到最近10年，它才成为对致病菌深入研究中的焦点，并且成为研究进展最快的微生物学领域之一。     

医学微生物学创新教育的实践与思考

医学微生物学课程教学实践中,强化创新教育理念,构筑适应创新教育的教学内容体系,改革教学方法与手段,搭建相应的实践平台,以着力培养学生的创新素质。