第二讲分子生物学基本技术

第二讲分子生物学基本技术胡以平在当今医学科学中，涉及“基因”的内容日益增多。作为一名医学科学工作者，了解一些有关的基本实验技术很有必要，它有助于对某些新概念和观点的认识和接受，以及科研的设计和开展。本文介绍几种常用的、与基因结构分析有关的分子生物学技...     

pdx-1基因克隆及其在人肝癌细胞系SMMC-7721中的表达

背景与目的克隆小鼠胰十二指肠同源框-12(PEGFP-C1pdx-1)基因,并构建pdx-1的表达载体。材料与方法通过RT-PCR方法从小鼠胰腺总RNA中克隆pdx-1基因,并将该基因构建到pEGFP-C1和pcDNA3.0中获得pdx-1的表达载体。通过观察荧光和RT-PCR方法检测表达载体转染SMMC-7721后pdx-1基因在细胞中的表达。结果克隆了883bp的pdx-1全长cDNA,成功构建了pEGFP-C1pdx-1和pcDNA3pdx-1两种表达载体。pEGFP-C1pdx-1转染SMMC-7721后,可观察到绿色荧光仅局限于细胞核中;通过RT-PCR方法在转染后的细胞中都检测到了pdx-1基因的转录。结论pdx-1表达载体的构建为进一步研究pdx-1基因在胰腺发育和肝干细胞增殖与分化方面的作用奠定了基础。     

人骨髓间充质干细胞在新生小鼠脑中的植入和分化

背景与目的:探讨人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)在体内向神经细胞分化的可能性.材料与方法:将标记绿色荧光蛋白的人骨髓间充质干细胞植入到新生3 d的小鼠侧脑室中,分别于移植后0 d,9 d和14 d处死受体鼠,取其脑组织,4%多聚甲醛固定后行冠状面冰冻切片,荧光显微镜下观察hMSCs的植入,激光共聚焦显微镜检测植入细胞神经特异性蛋白的表达,定位双重标记的植入细胞.结果:受体小鼠脑中均可检出植入的细胞,此类细胞表达神经元细胞特异的微管相关蛋白β-Ⅲ-Tubulin(Tuj1)、微管相关蛋白2(MAP2),一些细胞表达神经胶质细胞特异的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP).结论:hMSCs植入后受到脑组织特定微环境的影响,在体内可以向神经细胞分化并参与到发育的神经系统中.     

HBV3′末端缺失preS/S基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的克隆HBV 3′末端缺失preS/S基因,构建真核表达载体,转染真核细胞,为进一步进行功能研究奠定基础.方法采用PCR方法从乙型肝炎病毒全基因组中克隆preS/S基因,构建真核表达载体pcDNA3-preS/S,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定,通过脂质体转染Hela细胞系进行表达研究.结果1)克隆了3′末端缺失的preS/S基因;2)构建preS/S真核表达载体;3)转染细胞及G418筛选后得到preS/S基因稳定表达的细胞株.结论3′末端缺失的preS/S基因能够在胞内表达,此研究为基因的功能研究奠定了一定的基础.     

后基因组时代的基因工程小鼠

基因工程小鼠是当今生命科学中集成度最高的综合性研究体系之一，在认识“基因－蛋白质－生命现象”、制备人类疾病研究的实验动物模型，以及新药开发的评价体系等领域中具有重要作用。随着生命科学中功能基因组学的兴起和模式生物时代的到来，使得生物医药研究对基因工程小鼠的需求日趋增加，同时也促使基因工程小鼠技术体系得到了快速的发展。然而，在基因工程小鼠的产生中，仍存在着一些问题。它们的解决，则需加强一些与基因工程小鼠直接相关的基础问题和有潜在应用价值的基础问题的研究。     

乙型肝炎病毒(adr亚型)preS2-S基因转基因小鼠的建立

目的：建立可表达乙型肝炎病毒（adr亚型）包膜中蛋白的转基因小鼠品质。方法：通过原核显微注射法制备带有乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因的转基因小鼠。应用PCR方法筛选乙型肝炎病毒preS2-S基因转基因首建者（founder）小鼠，再以免疫组织化学法分析乙型肝炎病毒蛋白在这些小鼠中的表达特性，PCR和免疫组化均阳性的转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配用于传代培育，并用PCR法检测其子代小鼠。结果：共注射受精卵69枚。选取存活受精卵58枚分别植入4只假孕小鼠，产仔并存活23只。经尾组织DNA PCR筛选得到5只整合preS2-S基因的founder小鼠，免疫组织化学法发现其中3只小鼠的肝脏中表达HBsAg，进而对其中表达较强的阳性鼠进行保种。结论：所建立的乙型肝炎病毒（adr亚型）preS2-S基因转基因小鼠品系具有表达乙肝病毒中蛋白的生物学特性，这一品系的建立为中蛋的相关研究提供了技术平台。     

氧化苦参碱对乙型肝炎病毒转基因小鼠乙肝抗原表达的影响

目的：研究氧化苦参碱抗乙型肝炎病毒的作用,并初步探讨其作用机制。方法：以乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠ＩＣＲ－ＴｇＮ（ＨＢＶａｄｒ１．２）ＳＭＭＵ 为动物模型,运用ＥＬＩＳＡ和免疫组化的方法检测小鼠肝脏内乙肝抗原含量。结果：分别予氧化苦参碱１００, ２００, ３００ ｍ ｇ／ｋｇ 腹腔注射,１次／ｄ,３０ ｄ 后,乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内ＨＢｓＡｇ 和ＨＢｃＡｇ 的含量较空白对照组（予等体积生理盐水腹腔注射）均有明显的下降,且对两者作用一致;进一步的研究表明氧化苦参碱２００ ｍ ｇ／ｋｇ 作用１０ ｄ,２０ ｄ 时小鼠肝脏内ＨＢｓＡｇ 和ＨＢｃＡｇ 的含量较治疗前有明显的下降。结论：氧化苦参碱能降低乙型肝炎病毒转基因小鼠肝脏内ＨＢｓＡｇ 和ＨＢｃＡｇ 的含量,有抗乙型肝炎病毒作用。     

在北瑞典隔离种群中精神分裂症亲代的子代

对精神分裂症亲代的生育力和其子代的个体发育及精神分裂症的发病率等方面曾进行过研究,发现在精神分裂症亲代中,没有生理学的和原发性生殖损害的证据,并证实了精神分裂症母亲与其产科并发症之间没有显著联系。最近,Book等(1978)对精神分裂症家族中,晚期胎儿的死亡率进行研究,报告在精神分裂症亲代的孩子中,与未受累     

干细胞与生物医药

干细胞是指那些处于分化过程之中，具有分裂增殖能力、并能分化产生一种以上“专业”细胞的原始细胞。根据干细胞的分化潜能可将其分为全能性干细胞、多能性干细胞和专能性干细胞三大类。但是干细胞的分 化潜能是相对的，在特定的环境下干细胞可表现出一定的可塑性。目前，干细胞是生命科学的热点研究领域之一，而且进展很快。可以预料，这方面的知识和理论将有助于对个体发育认识的加深和为重大疾病防治手段的研究提供新的思路。     

干细胞样肝原始细胞的体外分化

目的：探讨干细胞样肝原始细胞集落体外分化的潜能。方法：分离孕13.5d的C57BL／6小鼠胎肝组织细胞并培养，第2天出现圆形成椭圆形干细胞肝原始细胞集落，随机挑取边界清楚的细胞集落分别培养，利用倒置相差显镜连续观察细胞生长过程中的形态学变化并用显微摄影记录结果，最后利用免疫细胞化学分析鉴定分化后细胞的性质。结果：干细胞样肝原始细胞集落在体外培养时可形成类似肝小叶的形状，集落中央大部分细胞分化成双核细胞，集落周边细胞仍为单核细胞，但体积明显增大，整个集中的细胞呈放射状排布。分化后，细胞群中的部分细胞表达成熟肝细胞标志白蛋白（albumin)，少部分细胞表达胆管上皮细胞标志细胞角蛋白19（cytokeratin19,CK19)，但所有细胞均不表达低分化肝细胞标志α－甲胎蛋白（α-fetoprotein,AFP)。结论：干细胞样肝原始细胞在体外具有我向分化能力，可分化为表达成熟肝细胞的胆管上皮细胞标志的细胞。