胰十二指肠同源盒基因-1启动子在肝干细胞分化研究中的应用

背景与目的利用报告基因监测肝干细胞向胰腺细胞的转分化潜能。材料与方法通过PCR从小鼠基因组中克隆胰十二指肠同源盒基因-1(Pancreaticduodenalhomeobox-1,PDX-1)启动子片段,构建PDX-1启动子调控的绿色荧光蛋白报告载体(pPDX-1EGFP),并利用报告载体标记的肝原始细胞系(Liverepithelialprogenitorcells,LEPCs)观察肝干细胞向胰腺细胞的转分化潜能。结果获得PDX-1启动子调控的绿色荧光蛋白报告载体及报告载体标记的LEPCs。结论pPDX-1EGFP报告载体的成功构建为研究LEPCs向胰腺细胞的转分化提供了简捷的分子工具。     

条件培养液改进小鼠胚胎干细胞嵌合体制备效率的观察

目的:探讨如何通过改善小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)的培养条件来维持其未分化状态,提高嵌合体的制备效率.方法:以普通ES细胞培养液为对照,以TX-WES培养液为ES细胞条件培养液分别对15代以上的未工程化ES细胞和糖皮质激素受体(GR)工程化ES细胞进行培养并筛选,通过囊胚注射制作嵌合体来比较2种不同培养液培养ES细胞后嵌合体制备效率的差别.结果:未工程化ES细胞以普通培养液培养其嵌合率为25.0%,以TX WES培养液培养其嵌合率提高到53.8%(P＜ 0.05);GR工程化ES细胞以普通培养液培养其嵌合率为15.0%,以TX-WES培养液培养其嵌合率提高到52.3%(P＜0.05).结论:应用TX-WES培养液改善小鼠ES细胞的培养条件可提高嵌合体的制备效率,该方法为基因剔除小鼠研究的顺利开展奠定了良好的基础.     

转基因操作后小鼠受精卵的移植数量与其胚胎发育率的关系

目的:研究不同受精卵移植数量与小鼠胚胎发育率的关系,以提高转基因小鼠制备效率.方法:取正常(共966枚受精卵,分6组,每组10～12例)及已进行显微操作的小鼠受精卵(共2349枚受精卵,分为5组),移入假孕的受体小鼠输卵管内,统计分析其生产率及得仔率.结果:正常组移植小鼠移植1～5,6～10,11～15,16～20卵组与移植21～25,26～30组比较得仔率高(P＜0.01).转基因组小鼠单侧输卵管内移卵11～15枚或16～20枚的组,其得仔率较其他(移植1～5、6～10、21～25枚各组)高(P＜0.01).结论:受精卵移植数量与转基因小鼠胚胎发育率有关,以一次移卵11～20枚效果最好.     

Diethylnitrosamine诱导的小鼠肝细胞癌中存在SP细胞

荧光染料Hoezhst33342可以与DNA结合，—直以来在细胞周期研究中得到广泛应用。1996年，GoDdeu等首次用Hoeehst33342染色的方法，从全骨髓细胞中分离出一小部分不着色的细胞，这类细胞具有很强的排除染料的功能。移植到经致死剂量处理的小鼠体内能够重建造血系统。这引起了人们的广泛兴趣。后来Kim M等通过进一步的深入研究将这种可以排出Hoezhst3334的能力称为SP（side population）表型，将具有这种表型的细胞称为SP细胞。根据SP细胞在不同种类干细胞中广泛存在并具有表型上的保守性，人们开始推测“SP表型”有可能作为潜在的新的干细胞标志，并决定着其功能方面的特性。     

TNF家族的新成员TRAIL cDNA的克隆及其在E.coli中的表达

目的：克隆Ｔｒａｉｌ基因ＣＤＮＡ全长,构建Ｔｒａｉｌ的原核表达载体,从而建立其原核表达体系。方法：通过抽提我周血淋巴细胞总ＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ克隆ＴｒａｉｌｃＤＮＡ,构建Ｔｒａｉｌ的原核表达载体,用限制性酶切和ＤＮＡ测序进行鉴定,以温度进行诱导表达,通过ＳＤＳ－ｐａｇｅ分析表达产物。结果：（１）克隆了Ｔｒａｉｌ基因ＣＤＮＡ全长,ＤＮＡ测序结果与报道的完全一致;（２）构建了Ｔｒａｉｌ基因核表达载体     

HBV表面抗原DNA疫苗对小鼠脏器影响的实验研究

目的：用乙型肝炎病毒（ＨＢＶ,Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ）表面抗原ＤＮＡ疫苗对小鼠进行基因免疫,观察主要脏器病理形态改变,探讨该ＤＮＡ疫苗是否对肝、肾、脾等有损伤作用。方法：用乙型肝炎表面抗原（ＧＢｓＡｇ）ＤＮＡ疫苗经肌肉注射法免疫小鼠;ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清抗ＨＢｓＡｇ抗体水平。免疫１２周后取小鼠肝、肾、脾等组织,观察其病原形态改变情况。结果：ＤＮＡ疫苗接种１周后,免疫组小鼠血清中可检测到抗ＨＢｓＡｇ抗体,１２周后多只小鼠脾脏明显增大,肝、肾组织切片染色观察,可见免疫组小鼠的肝、肾组织均有不同程度的病理改变。结论：ＨＢｓＡｇ ＤＮＡ疫苗可诱导小鼠机体产生特异性抗体（可诱发全面、持久的免疫应答）持续１２周以上,同时伴有脾脏肿大和肝肾损伤提示,该ＤＮＡ疫苗表达产物与免疫小鼠脏器病变有一定的关系,对其临床     

nm23H1正反义表达载体的构建

目的;构建ｎｍ２３Ｈ１正反义表达载体ｐｃ３ＡＮ和ｐｃ３ＡＭ。方法：将ｎｍ２３Ｈ１基因正,反向插入质粒ｐｃＤＮＡ３和ｐＲＣ／ＣＭＶ,并转染肝癌细胞ＳＭＭＣ７７２１。结果：转染正义表达载体后ｎｍ２３Ｈ１ｍＲＮＡ和蛋白表达水平增加,转染反义表达载体后ｎｍ２３Ｈ１ｍＲＮＡ和蛋白表达水平降低。结论：构建的载体能在肝癌细胞内有效表达。     

医学细胞生物学综合性实验教学的设计与实施

在实验课教学中开展综合性实验是医学细胞生物学实验课教学改革的重要内容.介绍的综合性实验以小鼠胚胎干细胞的培养和基因转染为主线,穿插细胞的基本特征、细胞增殖动力学、细胞骨架、细胞融合及染色体的制备等教学内容,基本包括了常规医学细胞生物学实验课教学的主要内容.从课程内容、课程实施、课程小结等方面来介绍这一综合性实验课程的开展情况.     

乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠的建立

目的：建立乙型肝炎病毒核心抗原（ayw亚型）转基因小鼠模型。方法：采用受精卵显微注射的方法制备转基因小鼠，以PCR、免疫组化和H－E染色法分析导入基因在小鼠基因组中的整合，肝脏中的表达及肝组织的病理变化。结果：得到6只基因组中整合了核心抗原基因的首建者（founder）小鼠，其中1只在肝细胞核和胞浆均有HBcAg的表达。将肝脏中表达的小鼠继续传代，F1代10只小鼠中的4只小鼠肝细胞有HBcAg的表达。结论：建立了乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠，核心抗原基因能够在小鼠肝脏中表达，并且可以遗传。