毛囊与体表来源上皮细胞的生物学差异

目的：观察毛囊及表皮来源上皮细胞之间的生物学差异,探讨其在创面愈合中的不同作用。方法：体外分离培养成人头皮毛囊及肢体皮肤来源的上皮细胞,通过β1-整合素及keratin15染色鉴定、细胞生长曲线测定、细胞克隆形成率比较及流式细胞仪分析等方法,比较两种细胞在细胞表面标志物、生长增殖、细胞周期等方面的生物学差异。结果：毛囊来源的上皮细胞的β1-整合素及keratin15染色均可见明显的阳性细胞,而体表皮肤来源的上皮细胞则多为阴性;在细胞的生长增殖方面两者存在一定的差异,但无统计学意义;细胞周期分析表明,毛囊来源的上皮细胞处于DNA合成期的细胞数明显高于体表皮肤来源的上皮细胞（23.44％傩11.33％,P〈0.05）;毛囊来源的上皮细胞的克隆形成率为15.3％,后者为6.7％,差异显著。结论：毛囊来源的上皮细胞在增殖潜力方面明显高于体表皮肤来源的上皮细胞,在创面愈合中可能起主导作用。     

褪黑素对烫伤大鼠毛囊细胞氧化应激损伤的保护作用

目的 了解早期应用褪黑素对烫伤大鼠皮肤残留毛囊细胞的保护作用.方法 将18只雄性SD大鼠分为烫伤组、治疗组和假伤组,每组6只.在烫伤组和治疗组大鼠背部造成30%TBSA的深Ⅱ度烫伤,假伤组浸入37℃水中25 s致假伤.烫伤组和治疗组大鼠在伤后1 h补充平衡盐液抗休克,假伤组不补液.治疗组大鼠伤后1 min和8、16 h腹腔注射褪黑素溶液(10 mg/kg).烫伤组和假伤组腹腔注射相同剂量的乙醇-等渗盐水溶液(两者体积比为1:99).于伤后6、12、24 h采集各组大鼠致伤区皮肤组织,检测丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量.采用原位缺口末端标记法和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)免疫组织化学法,检测致伤区皮肤组织残留毛囊细胞凋亡情况.结果 烫伤组大鼠伤后各时相点皮肤组织MDA含量均显著高于假伤组(P＜0.01),且伤后12 h升高达峰值;治疗组MDA含量较烫伤组明显降低(P＜0.05).GSH的变化情况与MDA相反.在荧光显微镜下可见残留的毛囊细胞呈蓝色,凋亡细胞呈绿色.烫伤组伤后6、12、24h细胞凋亡率分别为(20.2±3.4)%、(31.2±3.6)%、(22.4±2.7)%,均明显高于假伤组[(4.3±2.3)%、(5.1±2.5)%、(4.1±2.4)%,P＜0.01].治疗组伤后6、12、24 h细胞凋亡率分别为(10.9±3.2)%、(19.1±3.7)%、(13.1±3.4)%,均明显低于烫伤组(P＜0.05).烫伤组各时相点caspase-3阳性细胞评分均高于假伤组(P＜0.01),而治疗组均低于烫伤组(P＜0.05).结论 大面积深Ⅱ度烫伤后,大鼠氧化应激水平与毛囊细胞凋亡率关系密切;早期应用褪黑素,可以改善机体的氧化应激程度,进而对皮肤残留的毛囊细胞产生抗凋亡作用.     

人体病理性瘢痕组织中过氧化物酶体增殖物激活受体的表达

研究显示,过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR)除了促进脂肪形成和胰岛素稳态外,还参与许多细胞功能的调控,如拮抗转化生长冈子β1(TGF-β1)的促纤维化效应[1-3].作为一种拮抗组织纤维化的内源性保护因子,PPAR在一些器官纤维化(如糖尿病性肾小球硬化症)中旱弱表达[4-5].在皮肤的病理性瘢痕组织巾,PPAR、结缔组织生长因子(CTGF)和TGF-β1是否也有表达差异,是本研究的关注重点.     

酸性氧化电位水对铜绿假单胞菌感染的深Ⅱ度烧伤创面的效果

目的探讨酸性氧化电位水(EOW)用于冲洗铜绿假单胞菌感染的深Ⅱ度烧伤创面的临床效果,为医护人员合理选择液体进行创面冲洗与消毒提供依据。方法实验用SD雄性大鼠54只,在SD大鼠背部建立两个一致的铜绿假单胞菌感染的深Ⅱ度烧伤创面,随机分为3组,A组采用醋酸氯己定溶液冲洗、B组采用酸性氧化电位水冲洗、C组采用生理盐水冲洗擦干后,3组均用斯丽凯纳米银抗菌凝胶进行换药,记录换药后创面组织细菌含量的降低值和创面愈合过程中的创面收缩率、上皮化率和创面愈合时间,数据采用SPSS19.0统计软件进行处理。结果换药前后3组创面的细菌定量的差值差异明显,B组创面换药前后差值最大为(1.21±0.51)×108CFU/g,抑菌率为(52.41±6.42)%,差异有统计学意义(P<0.05);烫伤后早期两组创面的收缩率无明显差异,随着换药次数的增加,两组之间的差异逐渐增大;在烫伤第16天B组创面的上皮化率(89.79±5.43)%明显快于A组(62.35±9.65)%和C组(72.92±5.73)%,差异有统计学意义(P<0.05);B组创面愈合时间最短为(17.75±1.49)d,C组次之(22.00±2.20)d,A组时间最长(24.25±2.12)d,3组愈合时间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 EOW的杀菌能力和促进创面愈合能力明显优于醋酸氯己定溶液和生理盐水,是治疗深Ⅱ度烧伤创面的重要手段之一。     

热损伤角质形成细胞培养上清对真皮成纤维细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原及基质金属蛋白酶1表达的影响

目的探讨角质形成细胞(keratinocytes,KC)热损伤后对真皮成纤维细胞(fibroblasts,Fb)Ⅰ、Ⅲ型胶原及基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1,MMP-1)表达的影响。方法分离培养人正常Fb及KC,分别建立KC、Fb热损伤模型;收集正常及热损伤12 h后细胞培养上清,并配制成浓度为50%的细胞条件培养液。根据培养液不同将第3～5代Fb分为3组,分别采用含50%热损伤KC培养上清(A组)、含50%正常KC培养上清(B组)的条件培养液及单纯DMEM(C组)培养,24 h后收集3组细胞;另于培养0、1、2、6、12、24、48 h分别收集A组细胞。采用含50%热损伤Fb培养上清的条件培养液培养Fb,于0、1、2、6、12、24、48 h收集细胞。采用实时荧光定量PCR检测各时间点KC热损伤条件培养上清对FbⅠ、Ⅲ型胶原及MMP-1 mRNA表达影响,以及Fb热损伤条件培养上清对Fb MMP-1mRNA表达影响。结果 KC热损伤条件培养上清培养24 h,A组Ⅰ、Ⅲ型胶原及MMP-1 mRNA相对表达量均显著高于B、C组,差异有统计学意义(P<0.05)。培养2、6、12、24、48 h,A组Ⅰ、Ⅲ型胶原及MMP-1 mRNA相对表达量均高于0 h(P<0.05),1 h与0 h差异无统计学意义(P>0.05);随培养时间延长相对表达量逐渐增高,2 h后各时间点间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Fb热损伤条件培养上清培养1、2、6、12、24、48 h,MMP-1 mRNA相对表达量与0 h比较,差异均有统计学意义(P<0.05);培养2 h后相对表达量逐渐降低,各时间点间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论热损伤后KC培养上清对FbⅠ、Ⅲ型胶原及MMP-1的表达具有调控作用。     

严重烧伤大鼠血清对脂肪间质干细胞生物学特性的影响

目的 探讨严重烧伤大鼠血清对体外培养的大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)生物学特性的影响.方法 取雄性SD大鼠双侧腹股沟脂肪组织,采用胶原酶消化法、分离纯化大鼠ADSCs,取第3代细胞,采用流式细胞仪检测细胞表面标志物,行成脂成骨诱导分化鉴定;ADSCs传代后按随机数字表法分为10％胎牛血清组(正常培养组)、10％正常大鼠血清组,10％烧伤大鼠血清组,采用噻唑蓝(MTT)法测定各组细胞的生长曲线.通过流式细胞仪检测各组细胞的生长周期、Real-time PCR法检测各组细胞血管内皮生长因子(VEGF)、凋亡相关因子Caspase-3的表达情况.结果 分离培养的ADSCs传至第3代时形态规则,经流式细胞仪检测,所培养的ADSCs均表达CD29、CD90、CD105,阳性率分别为88.6％、99.7％、92.8％,而CD31、CD34、CD45阳性率分别为4.4％、4.7％、3.3％;经诱导培养后可向成骨成脂分化.MTT法检测结果显示:10％烧伤大鼠血清组细胞增殖较快,各时间点吸光度值(A值)明显高于10％胎牛血清组及10％正常大鼠血清组.流式细胞仪检测结果显示:培养1周后10％烧伤大鼠血清组、10％正常大鼠血清组、10％胎牛血清组ADSCs G1期细胞比例分别为:(72.20±5.13)％、(83.50±4.74)％、(90.20±6.37)％;S期细胞比例分别为:(21.40±2.84)％、(12.50±1.96)％和(8.60±1.31)％,10％烧伤大鼠血清组ADSCs G1期细胞比例显著低于10％正常大鼠血清组、10％胎牛血清组(t=2.39、4.86;P ＜0.05);10％烧伤大鼠血清组ADSCs S期细胞比例显著高于10％正常大鼠血清组、10％胎牛血清组(=5.54,7.93;P＜0.01).Real-Time PCR检测结果显示:10％烧伤大鼠血清组VEGF的表达明显上调,Caspase-3表达显著下调与10％正常大鼠血清组、10％胎牛血清组相比差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 10％烧伤大鼠血清可明显促进ADSCs的增殖、抑制细胞凋亡发生、促进ADSCs的分泌功能,严重烧伤后可望移植ADSCs用?     

Smad交互蛋白1在增生性瘢痕组织中的表达及其对纤维化相关因子的影响

目的研究Smad交互蛋白1（SIP1）在人增生性瘢痕组织中的表达及其对纤维化相关因子的影响。方法收集临床整形手术切取的9例患者增生性瘢痕标本及其自体正常皮肤标本。分离培养原代人增生性瘢痕成纤维细胞（HSFBs）,取第3-5代细胞用于实验。（1）免疫组织化学法检测增生性瘢痕组织标本及其自体正常皮肤组织标本中SIP1的表达情况。（2）真核表达质粒pcDNA3.1（＋）/SIP1转染HSFBs。按照随机数字表法将细胞分为6组：对照组;pcDNA3.1（＋）组（空载体组）;pcDNA3.1（＋）/SIP1组;对照＋TGF-β1组;pcDNA3.1（＋）＋TGF-β1组;pcDNA3.1（＋）/SIP1＋TGF-β1组。于转染后第48 h和72 h分别提取细胞总RNA和细胞总蛋白。应用实时荧光定量PCR法检测各组细胞α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）及结缔组织生长因子（CTGF）的mRNA表达水平;采用Western-blotting检测α-SMA的蛋白表达水平。结果 （1）免疫组织化学染色结果显示：增生性瘢痕组织中SIP1表达明显低于自体正常皮肤组织。（2）pcDNA3.1（＋）/SIP1转染HSFBs后纤维化相关因子的表达：①α-SMA的mRNA和蛋白表达水平：与对照组和pcDNA3.1（＋）组相比,pcDNA3.1（＋）/SIP1组在mRNA和蛋白表达水平均显著下调,差异有统计学意义（P〈0.05）。当细胞给予TGF-β1刺激后,各组α-SMA表达均上调,但pcDNA3.1（＋）/SIP1＋TGF-β1组mRNA和蛋白表达水仍低于对照＋TGF-β1组,差异有统计学意义（P〈0.05）。②CTGF的mRNA表达水平：与对照组和pcDNA3.1（＋）组相比,pcDNA3.1（＋）/SIP1组在mRNA表达水平显著下调,差异有统计学意义（P〈0.05）。当细胞给予TGF-β1刺激后,各组CTGF表达均显著上调,但pcDNA3.1（＋）/SIP1＋TGF-β1组mRNA表达水仍低于对照＋TGF-β1组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论与正常皮肤组织相比较,SIP1在增生性瘢痕组织中低表达。SIP1基因转染HSFBs可降低纤维化相关因?     

离体角质形成细胞热损伤模型建立及细胞凋亡观察

Objective To reproduce a model of heat injured KC in vitro and explore its apoptosis rate of KC due to heat injury at different temperature. Methods Human KCs were cultured in vitro, and they were incubated at 37, 41, 43,45, 48, and 51 ℃ respectively for 10 mins in water bath. Trypan blue staining and Hoechst 33258 fluorescence staining were used respectively to determine necrosis and apoptosis of KC. Rates of apoptosis and necrosis of KC were analyzed quantitatively by flow cytometer. The prolifera-tion activity of KC after heat injury was detected by MTT test. Results The results of trypan blue stai-ning, Hoechst 33258 fluorescence staining, and flow cytometer demonstrated that number of apoptotic and necrotic KC increased gradually along with a rise of water bath temperature. The rates of apoptosis and necro-sis of KCwererespectively(12.3±3.2)% and (14.1±1.6)% at 45℃, (27.7±5.1)% and (58.0± 4.2)% at 48 ℃. Rate of KC necrosis reached up to (83.0±5.3)% at 51℃. Inhibition of KC growth reached a stationary phase when the injurious temperature reached 45 ℃ as observed with MTT test. Con-clusions Heat injury can induce apoptosis and growth inhibition of KC in vitro. Incubating KC at 45 ℃ for 10 mins is a good condition to reproduce a model of heat injured KC in vitro. This model may be used to study the biological character and apoptosis of KC after burn injury.     

大鼠深Ⅱ度烫伤合并创面感染模型的构建

目的建立一种稳定性高、重复性好的深Ⅱ度大鼠烫伤合并创面感染的动物模型,用于烫伤合并创面感染的修复及治疗的研究。方法选取40只SD大鼠,随机分成5组,采用自制烫伤仪(蒸汽温度94℃)对大鼠皮肤进行烫伤,致伤时间点分别为4、6、8、10和12 s(每只大鼠脊柱两侧分别致伤2个相同创面),烫伤24 h后观察创面组织学变化,分析形成深Ⅱ度烫伤创面的最佳致伤时间。选取30只SD大鼠,随机分为3组,每组10只,采用最佳致伤时间形成深Ⅱ度烫伤创面,3组大鼠一侧创面分别接种浓度为1×10~7、1×10~8和1×10~(9 )CFU/mL铜绿假单胞菌菌液0.3 mL,另一侧均接种等体积生理盐水作为对照,接种24 h后观察大鼠创面一般状况,采用HE染色对创面进行染色并观察炎症反应,分别于接种1、2、4、7和14 d后检测痂下细菌数量,并记录大鼠创面愈合时间。结果(1)组织病理学结果显示,致伤时间为8 s是形成深Ⅱ度创面的最佳致伤时间。(2)大鼠深Ⅱ度烫伤创面接种1×10~8、1×10~(9 )CFU/mL细菌后均有明显的炎性细胞浸润,后者痂下炎性浸润更明显。烫伤创面接种1×10~(9 )CFU/mL细菌14 d内,痂下细菌含量均高于1×10~(5 )CFU/g,且随着时间延长细菌含量呈持续上升趋势。大鼠创面愈合时间为(21.4±2.4)d,较生理盐水对照组创面愈合时间(18.4±1.7)d明显延长(t=2.72,P0.05)。结论温度94℃,烫伤时间8 s为形成深Ⅱ度烫伤的最佳致伤时间;创面接种浓度为1×10~(9 )CFU/mL铜绿假单胞菌可建立烫伤深度一致、重复性高、稳定性好的SD大鼠深Ⅱ度烫伤合并感染模型。     

激活Hacat细胞表面Toll样受体促进创面愈合的机制

目的：细胞表面Toll样受体对激发先天性免疫、抵抗微生物感染有重要作用。最近研究发现激活细胞表面Toll样受体不仅可以预防微生物感染，还可以促进组织再生。实验通过脂多糖激活体外培养的角质细胞株Hacat细胞表面Toll样受体，观察其促进创面愈合的可能机制。 方法：实验于2007-07在解放军第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科完成。①实验分组及方法：角质细胞株Hacat由解放军第四军医大学西京医院皮肤科馈赠；脂多糖为Sigma公司产品；小鼠抗入Toll样受体2单克隆抗体、兔抗人Toll样受体4多克隆抗体购于ebioscience公司。体外培养Hacat细胞，根据脂多糖（500ng/L）与Hacat细胞共培养24，48，72h将细胞随机分为脂多糖作用24h组、脂多糖作用48h组、脂多糖作用72h组，另设对照组，只加溶剂二甲基亚枫。②实验评估：蛋自免疫印迹技术检测脂多糖对Hacat细胞Toll样受体2、Toll样受体4及核因子KB表达的影响：荧光定量聚合酶链反应检测脂多糖作用后Hacat细胞内基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子的表达。 结果：光学显微镜下正常入皮肤表皮及角质细胞Toll样受体2、Toll样受体4表达呈蓝黑色：脂多糖作用于Hacat细胞24，48，72h后Toll样受体2、Toll样受体4、核因子-κB表达均高于对照组（P〈0．01）。与对照组相比，其他3组基质金属蛋白酶3及血管内皮生长因子表达均增高（P〈0．01，P〈0．05）。脂多糖作用24h组基质金属蛋白酶9表达与对照组差异无显著性（P〉0．05），脂多糖作用48，72h组与对照组比较，差异显著（P〈0．05）。 结论：激活Hacat细胞表面Toll样受体有促进创面愈合作用，其机制可能与脂多糖作用了：Toll样受体从而激活核因子KB信号传导通路促进细胞释放基质金属蛋白酶3、基质金属蛋白酶9及血管内皮生长因子等因素有关?