人表皮生长因子受体显性负性突变体诱导胃癌细胞发生G0/G1期阻滞

 目的：探讨人表皮生长因子受体显性负性突变体（dominant negative epidermal growth factor receptor,DNEGFR）对胃癌细胞细胞周期的影响及其分子机制。方法：选用2株人胃癌细胞,分为如下6组：SGC-7901细胞未转染组（US组）、SGC-7901细胞pEGFP-N1质粒转染组(ES组)、SGC-7901细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DS组)、NCI-N87细胞未转染组（UN组)、NCI-N87细胞pEGFP-N1质粒转染组(EN组)和NCI-N87细胞pEGFPN1-DNEGFR质粒转染组(DN组)。采用流式细胞术检测细胞周期,Western blotting检测细胞周期素依赖性蛋白激酶2（CDK2）、cyclin D1、Ser9位点磷酸化糖原合成酶激酶3β［p-GSK-3β(Ser9)］、p21和p27蛋白水平。结果：转染pEGFPN1-DNEGFR质粒的人胃癌细胞株出现G0/G1期阻滞,CDK2、cyclin D1和p-GSK-3β（Ser9）蛋白水平降低,p21和p27蛋白水平则升高。结论：DNEGFR通过激活GSK-3β使cyclin D1蛋白水平降低,并降低CDK2蛋白水平,上调p21和p27蛋白水平,最终导致胃癌细胞发生G0/G1期阻滞。这一结果将为胃癌生物治疗研究提供新思路。     

长程无血清培养人乳腺癌细胞球的生物学特性

目的:从人乳腺癌原代细胞中分离培养乳腺癌干/祖细胞,并通过体外连续传代培养,研究其体外增殖、分化等生物学特性.方法:应用非黏附性乳腺球(mammosphere,MS)悬浮培养法富集乳腺癌干/祖细胞后,通过连续的单克隆实验检测乳腺球细胞(mammosphere-derived cells,MSDC)的克隆形成和自我更新能力,并经血清诱导后观察其分化能力.FCM法检测CD44~+/CD24~(-/low)细胞的含量.结果: 接种于含生长因子无血清培养液的原发乳腺癌标本细胞均有MS生成,内含具有干细胞特征的肿瘤细胞.随着培养中传代次数的增加,贴壁分化的细胞增多,形成的MS减少,球体变小,且更易贴壁分化.CD44~+/CD24~(-/low)细胞仅存在于基底样乳腺癌标本.来自不同标本的MS的生物学特性表现出一定差异.结论:具有自我更新、无限增殖和多向分化等干细胞样特性的肿瘤细胞在人乳腺癌组织中广泛存在,其生物学行为可能因标本来源不同有所差异,也会因环境因素的作用而改变.     

苦参碱诱导U937细胞分化及其相关机制

目的:观察苦参碱对U937细胞诱导分化作用,并探讨其可能作用机制.方法:采用流式细胞仪检测细胞周期分布;硝基四氮唑蓝(NBT)还原实验、CD11b,CD14表面抗原的表达及细胞形态学检测细胞分化;Western Blot检测p21Waf1/Cip1的蛋白表达.结果:苦参碱作用U937细胞后,细胞周期分析提示发生S期阻滞;NBT阳性细胞率明显增高(P<0.05),CD11b表达增加(P<0.05);细胞内p21Waf1/Cip1表达增高(P<0.05).结论:苦参碱能诱导U937细胞分化,其机制可能与细胞周期调控蛋白p21Waf1/Cip1表达的改变有关.     

金雀异黄素与5-氟尿嘧啶单独或联合抑制人胃癌BGC-823细胞的体外研究

目的：研究金雀异黄素（Genistein,Gen）与5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）联合应用对人胃癌细胞BGC-823的生长抑制是否具有协同作用及其可能的作用机制。方法：MTT法检测Gen、5-FU单独及联合对BGC-823细胞生长的抑制作用并用中效原理定量分析两药合用的剂量-效应关系。Gen、5-FU单独及联合处理BGC-823 细胞72 h后,流式细胞术检测细胞周期分布的变化,并在透射电镜下观察细胞超微结构的改变。结果：Gen、5-FU单用或联合应用对BGC-823细胞的生长均有显著的增殖抑制作用且呈剂量和时间依赖性。两药联合应用时,当药物效应（抑制率）大于50%时,具有协同作用[合用指数（Combina－tion index,CI）≤1];6.06 mg/L Gen作用72 h后,95.74%的BGC-823阻滞在G2/M期;1.23 mg/L 5-FU作用72 h后,G0/G1及S期细胞分别为58.26%和41.59%,0.81 mg/L Gen与1.01 mg/L 5-FU联合应用72 h后,67.99%的BGC-823细胞阻滞在G0/G1期。Gen、5-FU单独或联合均可诱导BGC-823细胞凋亡。结论：Gen和5-FU单独或联合应用,均对BGC-823细胞具有抑制增殖的作用,在一定浓度范围内,Gen与5-FU联合应用对胃癌细胞的增殖具有协同抑制作用,Gen与5-FU可能通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡而抑制胃癌细胞的生长。该研究为Gen与5-FU可能联合用于胃癌的治疗提供了依据。     

奥沙利铂抗人结肠癌细胞株HT29增殖及其机制的研究

目的 观察抗肿瘤药物奥沙利铂对人结肠癌细胞株HT29体外增殖的影响,初步探讨其作用机制.方法 采用人结肠癌细胞株HT29作为研究对象,MTT法检测不同浓度和作用时间的奥沙利铂对细胞增殖的抑制作用;透射电镜观察细胞形态和超微结构的改变;流式细胞仪分析细胞周期的分布及凋亡的情况;免疫细胞化学法检测细胞周期蛋白及凋亡相关基因蛋白的表达.结果 奥沙利铂对HT29细胞的增殖有抑制作用而且呈剂量和时间依赖性.奥沙利铂作用72 h后,电镜可见凋亡细胞及凋亡小体;流式细胞仪检测发现细胞阻滞于G2/M期,G0/G1、S期细胞减少及出现凋亡峰;免疫细胞化学显示Bax和Fas表达增强,CyclinB1、Bcl-2、PCNA表达减弱.结论 奥沙利铂对HT29结肠癌细胞的增殖有抑制作用,其作用机制与细胞周期阻滞及诱导细胞凋亡有关.     

阿魏酸钠对培养大鼠大脑微血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用

目的：研究缺氧对脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMEC）的损伤及阿魏酸钠（Sodium ferulate）对它的保护作用.方法：取体外培养的大鼠脑皮质微血管内皮细胞,置于95%N2和5%CO2的缺氧盒中12h造成内皮细胞缺氧.用透射电镜观察BMEC的超微结构变化.用内皮细胞线粒体活性和内皮细胞死亡率来评价内皮细胞活力,并用乳酸脱氢酶（LDH）漏出量作为评价损伤的指标.结果：体外培养大鼠脑皮质BMEC缺氧12h后,细胞超微结构损伤,细胞存活率及线粒体活性明显降低,LDH释放量显著增加.阿魏酸钠可显著对抗缺氧对BMEC的损伤.结论：阿魏酸钠对大鼠脑皮质BMEC缺氧损伤具有保护作用.     

Wortmannin抑制PDK信号通路对人甲状腺滤泡癌细胞迁移侵袭能力的影响

目的 利用特异性PI3K抑制剂wortmannin抑制P13K信号通路,研究其对人甲状腺滤泡癌细胞CGTHW-1迁移和侵袭能力的影响,并初步探索其作用机制.方法 培养CGTHW-1细胞,用MTT法筛选wortmannin最佳作用浓度及时间.将细胞分为实验组和对照组(分别在血清饥饿和含血清两种条件下培养).对照组细胞未给予任何处理,实验组细胞用wortmannin进行处理.通过划痕实验、Transwell小室侵袭实验分别观察wortmannin对细胞迁移及侵袭能力的影响.利用FITC标记的鬼笔环肽进行微丝免疫荧光染色,观察在wortmannin作用下细胞的形态学变化.免疫细胞化学SP法及半定量RT-PCR法检测wortmannin对细胞Racl蛋白、mRNA表达的影响.结果 在含血清培养液培养条件下,经wortmannin处理后,划痕伤口愈合速度减慢,CGTHW-1细胞侵袭至小室下层细胞数(13.8±3.03个)明显低于对照组(41.6±6.95个,P<0.01);wortmannin显著降低Racl蛋白及mRNA的表达(P<0.05).而在血清饥饿条件下,两组细胞迁移均受抑制,侵袭细胞数组间差异无统计学意义(P>0.05).结论 wortmannin能有效抑制人甲状腺癌细胞迁移侵袭,其作用机制可能是通过抑制PI3K下游分子Racl,从而引起细胞骨架重构.PI3K及Racl可能成为抑制甲状腺癌转移的关键性分子.     

小鼠肝癌细胞H22源exosomes的制备及其免疫相关蛋白的初步研究

目的 分离提取和电镜观察小鼠肝癌细胞H22分泌的exosomes,并检测其含有的蛋白成分,为exosomes作为肿瘤疫苗提供理论依据。方法 超速分级离心和蔗糖密度梯度离心纯化得到exosomes,并经透射电镜观察鉴定,运用肽质量指纹谱质谱分析和Western blot检测exosomes含有的蛋白成分。结果 从小鼠肝癌细胞H22中提取出exosomes,直径约为20-90 nm的膜性囊泡,呈圆形或椭圆形。该exosomes含有热休克蛋白（HSP）70、ICAM-1、延伸因子G2、动力蛋白轻链A、C-myc和Vav-2蛋白。结论 超速分级离心和蔗糖密度梯度离心提取纯化exosomes的方法具有可行性,小鼠肝癌细胞H22源exosomes表达有与抗原呈递相关蛋白（HSP70、ICAM-1）,迁移相关蛋白（动力蛋白轻链A）,粘附相关蛋白（ICAM-1）,细胞骨架相关蛋白（延伸因子G2）,肿瘤相关蛋白（C-myC蛋白、Vav-2蛋白）,具有免疫原性。     

解聚复肾宁对大鼠肾小球系膜细胞增殖和细胞外基质分泌的影响

目的:探讨解聚复肾宁(黄芪、地黄、黄连、丹参、姜黄、葛根等)(JJFSN)治疗早期糖尿病肾病(DN)的作用机制。方法:高糖诱导系膜细胞(MC)增殖以及细胞外基质(ECM)分泌,制备不同浓度JJFSN含药血清作用于体外培养的MC,用MTT法检测细胞增殖,放射免疫技术(RIA)检测细胞培养上清中Ⅳ型胶原(ColⅣ)及层黏连蛋白(Ln)的含量。结果:JJFSN含药血清可抑制高糖诱导的MC过度增殖(P0.05),并且这种作用具有药物剂量和时间依赖关系。同时,JJFSN可逆转高糖对ColⅣ和Ln分泌的影响,降低MC培养上清中ColⅣ和Ln的含量(P0.05),并且这种作用随着JJFSN剂量的增加而增强。结论:JJFSN抑制高糖诱导的MC过度增殖并减少ECM的过量分泌,可能是其防治DN早期的作用机制。