重组人脱氧核糖核酸酶预防冻存复苏后脐血造血干细胞凝集

自1988年Gluckman等[1]用脐血移植治疗Fanconi贫血患儿并获得成功后,脐血已经作为一种重要的可替代的造血干细胞来源广泛应用于治疗某些恶性及非恶性血液病、某些遗传病、重症免疫缺陷等疾病[1～3].脐血库的建立日益受到重视,如何经济、高效地体外保存造血干细胞,使干细胞的损伤降到最低限度,提高脐带血干细胞移植的成功率,一直是人们关注的焦点.许多研究证明脐带血保存前的浓缩,是提高临床移植应用效率的关键,但是复苏过程会造成干细胞的损伤,尤其是冷冻和复苏时粒细胞受损释放的DNA及细胞碎片易形成凝块和微凝集导致干细胞损失从而影响移植效果.Eichler等[4]报道重组人脱氧核糖核酸酶(rhDNase)能特异性裂解DNA.笔者采用不同浓度的rhDNase处理复苏后的脐血干细胞,观察其抑制凝集的效果,并且运用免疫荧光直接四色标记和流式细胞术检测不同浓度rhDNase对相关黏附分子表达的影响,现报道如下.     

医护一体化护理对食管癌患者术后应激反应与近期生存质量的影响

目的：探讨医护一体化护理干预对食管癌患者术后应激反应和近期生存质量的影响。方法将62例食管癌患者采用随机数字表法随机分为干预组32例和对照组30例,两组患者均于手术当日晨（术前）、术后第5天（术后）采集静脉血分别测定应激反应指标含量,包括空腹血糖（ FBG）、C-反应蛋白（CRP）、白细胞介素-6（IL-6）、血浆皮质醇（Cor）。对照组采用常规护理模式,干预组采用医护一体化护理模式。采用生存质量问卷调查表评价两组患者术前和术后2周的生存质量,并进行比较。结果术前干预组与对照组患者FBG、CRP、IL-6和Cor的水平差异均无统计学意义（P＞0．05）。术后第5天,对照组患者的FBG、CRP和Cor水平高于干预组,差异有统计学意义（ t值分别为3．724,7．203,4.137;P＜0．05）,IL-6水平差异无统计学意义（t＝0．452,P＞0．05）。两组患者术后第5天FBG、CRP、IL-6和Cor的水平均高于术前水平,差异有统计学意义（ t值分别为3．031,5．361,2．864,3．534和6．990,10.755,2．415,8．166;P＜0．05）。生存质量评价中,两组患者术前各功能项目和症状项目得分差异无统计学意义（P＞0．05）;手术后2周干预组的全部功能项目得分高于对照组,差异有统计学意义（P＜0.05）;干预组症状项目得分均低于对照组,其中7项得分差异有统计学意义（P＜0．05）,2项差异无统计学意义（ P＞0．05）。结论医护一体化护理干预能减轻食管癌患者术后的应激反应,提高患者的近期生存质量。     

检测STR多态位点作为非性别依赖胎儿标记的探讨

本研究探讨检测孕妇血浆中游离胎儿DNA短串联重复序列（short tandem repeat,STR）多态位点作为内对照进行遗传病产前基因诊断的可行性。用QIAamp DNA Kit抽提孕妇血浆DNA,应用AmpFlSTR profiler试剂盒扩增9个（D3S1358,VWA,FGA,D5S818,D13S317,D7S820,D8S1179,D21S11,D18S51）具有高度多态性的STR位点,以多重荧光PCR方法对不同孕期的36份孕妇血浆标本中胎儿DNA进行STR等位基因扩增,同时扩增孕妇及丈夫外周血来源DNA的STR位点。PCR产物经ABI Prism 377序列分析仪电泳后,用基因扫描软件进行分析,以在孕妇血浆中胎儿DNA检出父源性STR等位基因来确认胎儿DNA存在。结果表明：其中孕早期4份（4/6）、孕中期19份（19/20）、孕晚期9份（9/10）样本中检出胎儿父源性等位基因,即胎儿DNA。4份样本未检到胎儿DNA。结论：应用多重荧光PCR方法对孕妇血浆中胎儿DNA进行STR多态位点的复合扩增,可获得男性及女性胎儿性别DNA信息,作为非性别依赖胎儿标记,从而用于无创伤性产前诊断。     

脐血造血干细胞短期冻存效果的评价

为了探讨脐血造血干细胞在液氮中短期冻存复苏后的效果，分别将各自为8例冻存6个月、1年、2年的脐血千细胞进行复苏，观察造血干细胞活性。有核细胞(NC)计数采用自动血细胞分析仪测定，CD34^ 细胞采用流式细胞技术测定，用体外造血细胞培养技术分析粒一巨噬细胞集落生成单位(CFU-GM)产率，台盼蓝染色法判断造血细胞存活率。结果表明：脐血造血干细胞在液氮中冻存6个月、1年、2年后解冻，其有核细胞、CD34^ 细胞、细胞活率、CFU-GM产率在3个不同冻存时间的差异无显著性。结论：脐血干细胞于液氯中短期冻存，其干细胞数量和细胞活性没有明显的变化，冻存效果较好。     

RHD基因的克隆及其在K562细胞中的表达

本研究目的在于克隆人类红细胞RHD基因，构建RhD表达载体，观察其在K562细胞中的表达。从脐血网织红细胞中提取总RNA，采用逆转录聚合酶链反应扩增RHD／CE基因，扩增产物通过TA连接克隆到pGEM-T质粒，采用测序方法筛选多个克隆获得RHD基因。将获得的RHD基因进一步亚克隆构建pcDNA3．1(-)表达载体。重组表达载体通过superfect试剂盒转染K562细胞，最后观察K562细胞中RHD基因的转录和表达。结果表明：成功分离克隆到RHD基因，构建的pcDNA3.1(-)重组表达载体经酶切和测序证实RHD cDNA序列及插入方向正确。转染后的K562细胞内有相应的mRNA转录，细胞表面有RhD抗原表达。结论：RHD cDNA转染的K562细胞能表达RhD抗原，该表达体系有助于进一步研究各种RhD变异型的分子基础。     

实时荧光定量PCR检测孕妇血浆中胎儿RhCcEe基因

Rh血型系统在临床输血中的重要性仅次于ABO血型系统[1],Rh血型不合可引起溶血性输血反应及新生儿溶血病(HDN)[2].Lo等[2]研究证实孕妇血浆或血清中含有胎儿DNA,国外已用游离胎儿DNA开展了非创伤性产前诊断Rh基因的研究[4-7].我们曾用PCR扩增孕妇血浆中胎儿DNA,以检测胎儿RhCcEe基因[8].     

流式细胞仪检测HLA-B_(27)抗原初探

目的　建立一种快速、准确的HLA B2 7检测技术。方法　利用流式细胞仪 (FCM)检测HLA B2 7抗原 ,并将结果与基因定型法比较 ,74例临床样本分别用FCM法、PCR ASP基因定型法检测HLA B2 7抗原和基因。结果　FCM法有 2 2例HLA B2 7阳性 ,5 2例阴性 ,与PCR ASP法结果比较 ,阳性符合率 88% ,阴性符合率 10 0 % ,总观察一致率 95 .9% ,二种检测方法无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　可以认为 ,FCM法检测HLA B2 7具有快速灵敏、多参数检测等优点 ,针对不同的样本来源和临床要求 ,与PCR ASP法配合使用 ,能在临床强直性脊椎炎等疾病诊断中发挥重要作用     

1963份脐血造血干细胞的处理与保存

本研究目的是建立脐血造血干细胞库的标准工作程序。采用自然沉降法加离心法制备脐血的造血干细胞 ,经CD34 细胞计数、集落培养、微生物检测、传染病指标检测、HLA分型后 ,将造血干细胞贮存在液氮中保存。结果表明 :贮存脐带血造血干细胞有核细胞数平均值为 (10 .94± 2 .74 )× 10 8,回收率为 (79.82± 17.76 ) % ,CD34 细胞数平均值为 (5 1.6 2± 30 .5 3)× 10 5。 8份脐带血造血干细胞冰冻 2年后复苏 ,其有核细胞、CD34 细胞、CFU GM回收率分别为 (91.4± 6 .0 ) %、(84 .6± 2 0 .0 ) %、(85 .8± 14 .9) %。结论 :本方法和程序能有效地保存脐带血造血干细胞。     

流式细胞仪法用于血小板相关抗体检测和血小板交叉试验

目的 应用流式细胞仪(FCM)进行血小板相关抗体检测和血小板交叉试验。方法 利用血小板抗体阳性、阴性血清探寻FCM法实验条件,血小板经血清致敏,洗涤后,加入荧光标记鼠抗人IgG反应,由FCM获取和分析。52人次正常人血清经FCM法检测后,统计界定正常值范围。1份阳性血清经9个稀释度倍比稀释,分别用FCM法和固相ELISA抗体筛选法检测。31名临床血小板输注无效患者分别用FCM法和抗原捕获酶免分析法(MACE)进行102人次血小板交叉配合试验。结果 FCM法检测正常值为荧光强度比值R<1.156,9个稀释度的阳性血清检测表明,FCM法最高可检稀释度为86.67,固相ELISA法最高可检稀释度为56.34(抗-HPA)和67.25(抗-HLA)。102人次血小板交叉结果显示,FCM法和MACE法无显著性差异(P>0.05)。结论 FCM法可用于血小板相关抗体检测和血小板交叉配血,是一种快速、灵敏的新方法。     

细胞洗涤机自动洗涤解冻红细胞的探讨

目前最常见的红细胞冰冻保存的保护剂为甘油 ,临床应用前须经一定的程序洗涤才能去除。国内大多采用手工洗涤的方法 ,但其操作不够简便 ,所需时间长。本实验室采用 Haemonetics公司的 1 1 5型细胞洗涤机进行洗涤 ,并对仪器的参数进行了优化 ,取得了较好的效果。现将结果报告如下。材料与方法1　主要试剂与材料　甘油 (兰溪市化工试剂厂 ,分析纯 ) ;冰冻血袋和 5 .0 4 mmol/L高盐 Na Cl溶液由北京博桑特输采血器材开发中心提供 ;羟乙基淀粉溶液由江苏常熟制药厂提供 ;0 .5 0 4 mmol/L生理盐水由上海血液中心提供。细胞洗涤一次性耗材由Hae…