用Taq Man探针实时定量PCR法快速检测鼠疫耶尔森菌

目的　建立一种快速、准确、特异的定量检测鼠疫耶尔森菌的方法。方法　针对鼠疫耶尔森菌特异的染色体标识序列设计引物和TaqMan探针,进行实时定量聚合酶链反应(polymerasechainreaction ,PCR)分析,优化反应体系,检测其灵敏度、特异性和重复性。结果　以EV76灭活培养物为对象,检测灵敏度可达每反应体系0 .0 8CfU ;30株非鼠疫菌株的检测结果表明,对照菌株均为阴性,检测特异性良好;对同一样品进行17次重复检测,其循环阈值的标准偏差为0 .35。结论　TaqMan探针法能够灵敏、特异、稳定地对鼠疫耶尔森氏菌进行定量检测,为鼠疫监控、诊断提供有力手段     

鼠疫耶尔森氏菌荧光标记扩增片段长度多态性分型方法

目的 建立荧光标记扩增片段长度多态性(FAFLP)技术平台，探讨鼠疫菌基因分型。方法 用5种核酸限制性内切酶消化鼠疫菌基因组DNA，选择最佳内切酶组合，酶切片段经接头连接后，用荧光素标记的5条EcoRⅠ引物和9条MseⅠ引物组成的引物配对扩增，选择最佳引物组合，进行系列PCR条件的优化。扩增产物经ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer(遗传分析仪)检测，GeneScan等软件进行分析。结果 成功建立FAFLP技术平台。结论 FAFLP具有快速、简便、廉价、分辨率高、重复性好和污染少的优点，可用于鼠疫菌的基因分型分析。     

鼠疫亚单位疫苗的免疫学效果评价

9.10,P<0.01),而豚鼠和兔产生的F1 IgG抗体滴度的差异无统计学意义(q=0.06,P=0.81).亚单位疫苗免疫的小鼠、豚鼠和兔免疫保护率分别为100%(10/10)、86%(12/14)和100%(5/5);EV76疫苗免疫的小鼠、豚鼠和兔免疫保护率分别为100%(6/6)、93%(13/14)和100%(6/6).结论 BALB/c小鼠是较好的评价鼠疫亚单位疫苗的小型动物;豚鼠评价鼠疫亚单位疫苗存在较大个体差异;兔也可用作评价鼠疫亚单位疫苗的动物.     

用TaqMan探针实时定量PCR法快速检测鼠疫耶尔森菌

目的建立一种快速、准确、特异的定量检测鼠疫耶尔森菌的方法。方法针对鼠疫耶尔森菌特异的染色体标识序列设计引物和TaqMan探针，进行实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)分析，优化反应体系，检测其灵敏度、特异性和重复性。结果以EV76灭活培养物为对象，检测灵敏度可达每反应体系0．08CfU；30株非鼠疫菌株的检测结果表明，对照菌株均为阴性，检测特异性良好；对同一样品进行17次重复检测，其循环阈值的标准偏差为0．35。结论TaqMan探针法能够灵敏、特异、稳定地对鼠疫耶尔森氏菌进行定量检测，为鼠疫监控、诊断提供有力手段。     

用聚合酶链反应微孔板杂交技术检测HBV DNA

目的 :建立并优化HBVDNA的PCR 微孔板杂交技术检测体系 ,使临床PCR结果判定更加客观可靠。方法 :采用碱裂解标本中的HBV、玻璃粉吸附提纯模板DNA ,用 5’端标记生物素的引物进行PCR ,PCR扩增产物与包被于微孔板中的靶基因杂交 ,酶标链霉亲和素与杂交体中的生物素结合后 ,用酶底物与所标记酶进行显色反应 ,最后通过测定其光密度来判定结果。结果 :建立并优化的PCR 微孔板杂交检测方法提高了检测的灵敏度和特异性。PCR 微孔板杂交法对HBVDNA的检出阳性率 (79.8% )比电泳法 (6 9.0 % )高 ,2 0份非乙肝患者血清标本两方法检测均阴性。结论 :本方法灵敏、特异、操作简便、快速、结果客观可靠。     

DNA探针检测痢疾杆菌和侵袭性大肠杆菌的研究——17kb和2.5kb探针及其与Sereny试验的比较

用~(32)P标记17kb和2.5kb两个侵袭基因小片段作探针、分别与168株痢疾杆菌、60株侵袭性大肠杆菌及300株沙门氏菌属等作菌落杂交。结果表明:两个探针均只与携带120—140Md侵袭性大质粒的菌株杂交,而未见与其它对照株产生非特异阳性,但17kb探针能与Is_1序列产生可见的杂交背景。Sereny试验表明,探针杂交阳性的菌株,并非都能引起豚鼠眼结膜炎;而Sereny试验阳性者,经传代保存也可转变为阴性。     

炭疽芽孢杆菌芽孢适配子的结构与亲和性分析

为了对炭疽芽孢杆菌疫苗株A．16R芽孢的适配子进行亲和性分析,体外构建了78个碱基的随机DNA库,以炭疽芽孢杆菌疫苗株A．16R芽孢为靶标,用SELEX技术进行了15轮的筛,针室的适配子库进行克隆,测序,用Macaw2.05和DNAsisv2.5软件对每一适配子的保守序列和二级结构进行分析,并用生物素－链酶亲和素－辣根酶系统检测,根据OD值的高低判定亲和力的大小,对每一适配子进行亲和力测定。结果表明,适配子的亲和力高低不一,OD值最高为1．2,最低为0．25,二级结构分析结果显示,茎环和茎等二级结构可是适配子与芽孢结合的基础;其一级结构提示有AGGGG,CCCCG,GGCTT、ACACT等保守序,上述分类与OD值的高低分布基本吻合。     

鼠疫耶尔森菌中国分离株菌体脂肪酸成分分析

目的 探讨利用脂肪酸组织对中国鼠疫耶尔森菌菌株进行分型的可能性,获得中国鼠疫耶尔森菌菌株脂肪酸组成的本底资料。方法 选择历年来从我国不同疫源地分离到的58株鼠疫耶尔森菌进行了菌体脂肪酸成分分析。并利用STATISTICA统计软件进行实验菌株的聚类分析。结果 中国鼠疫耶尔森菌菌株的主要脂肪酸分为16：0酸,环式17：0酸,3-羟基14：0酸和ω7c16:1酸以及十八碳单烯酸,与MIDI公司Sherlock系统的菌库中的数据存在一些差异。结论 实验菌株的脂肪酸成分极为接近,聚类图不能充分体现分离株在分离时间,地点以及生物型别上的差异。表明脂肪酸分析目前不适于鼠疫耶尔森菌的分型,根据实验结果,建立了中国鼠疫耶尔森菌菌株的脂肪权组成数据库。     

三种致病耶尔森氏菌Hsp60基因序列的比较研究

目的　研究 3种致病耶尔森氏菌Hsp6 0基因序列的差异。方法　根据文献和基因库中的Hsp6 0基因序列设计了两对PCR引物 ,获得Hsp6 0基因的部分序列。将扩增产物纯化回收 ,克隆至 pGEM -T载体后进行测序。 结果　用CLUSTALX软件进行序列分析 ,发现 3种耶尔森氏致病菌的Hsp6 0基因序列较为保守 ,其中鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌的该基因序列在所研究范围内仅相差一个碱基。结论　 3种菌的Hsp6 0基因保守 ,不足以在此区间设计种特异性探针。小肠结肠炎耶尔森氏菌与鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌的Hsp6 0基因序列差异较大 ,易与这两个种区分开     

用UDPE技术检测和鉴定鼠疫耶尔森氏菌

我们建立了用ＵＤＧ（尿嘧啶糖基化酶）防ＰＣＲ产物污染,以两个不同基因为靶序列扩增检测同一病原菌和用微孔板杂交－酶联显色检测ＰＣＲ产物的ＵＤＰＥ（ＵＤＥ－ＤｕｐｌｅｘＰＣＲ－ＥＩＡ）技术并用于鼠疫耶尔森氏菌的检测与鉴定。结果表明,该系统可以特异地检测和鉴定鼠疫耶尔森菌,检测灵敏度可以达到１ＣＦＵ／ｍｌ。