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21.
卢康荣;王娟;邓鹏;罗海华;钟钦松;钟明明;姜勇 《广东医学》2010,31(17)
目的 构建小鼠S100 A8基因启动子序列的报告基因载体,通过报告基因技术检测在静息、脂多糖(LPS)、PolyI:C及NaASO2等刺激下该段启动子的转录活性。方法 采用PCR从小鼠脾组织基因组DNA扩增S100A8启动子序列(-826~+468);将其克隆至pDsRed1-1载体上,重组质粒经过PCR、酶切及测序分析正确无误后转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,荧光显微镜下观察静息、LPS、PolyI:C和NaASO2刺激下红色荧光蛋白表达。结果 正确扩增出小鼠S100A8启动子片段(-826~+468);成功构建其红色荧光蛋白报告基因载体,证实该质粒转染RAW 264.7细胞后静息状态下仅可见少量而微弱的红色荧光,经LPS、PolyI:C和NaASO2刺激后,红色荧光强度和亮度明显增加。结论 小鼠S100A8启动子(-826~+468)在静息状态下即具有转录活性,炎性、氧化应激刺激后S100A8表达增强;该启动子的成功克隆和其报告基因载体的构建,为进一步研究S100A8的基因表达调控机制打下了良好的基础。 相似文献
22.
目的 构建小鼠S100A8基因启动子序列的报告基因载体,通过报告基因技术检测在静息、脂多糖(LPS)、PolyI:C及NaASO2等刺激下该段启动子的转录活性.方法 采用PCR从小鼠脾组织基因组DNA扩增S100A8启动子序列(-826~+468);将其克隆至pDsRed1-1载体上,重组质粒经过PCR、酶切及测序分析正确无误后转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,荧光显微镜下观察静息、LPS、PolyI:C和NaASO2刺激下红色荧光蛋白表达.结果 正确扩增出小鼠S100A8启动子片段(-826~+468);成功构建其红色荧光蛋白报告基因载体,证实该质粒转染RAW 264.7细胞后静息状态下仅可见少量而微弱的红色荧光,经LPS、PolyI:C和NaASO2刺激后,红色荧光强度和亮度明显增加.结论 小鼠S100A8启动子(-826~+468)在静息状态下即具有转录活性,炎性、氧化应激刺激后S100A8表达增强;该启动子的成功克隆和其报告基因载体的构建,为进一步研究S100A8的基因表达调控机制打下了良好的基础. 相似文献
23.
目的构建小鼠多嘧啶束结合蛋白相关剪切因子(PSF)真核表达载体并在小鼠Hepa1-6肝癌细胞内表达,观察PSF胞内定位及脂多糖(LPS)对其定位的影响。方法提取小鼠肝组织总RNA,RT-PCR扩增小鼠PSF基因的蛋白编码序列;采用基因重组技术将其亚克隆至pcDNA3-HA真核表达载体中,将该载体瞬时转染Hepa1-6细胞,通过细胞免疫荧光方法观察PSF的胞内表达及LPS对其定位的影响。结果酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;细胞免疫荧光可见PSF在Hepa1-6细胞内表达后只分布于细胞核,LPS刺激后PSF分布无明显变化。结论成功构建PSF真核表达载体,为研究PSF在基因表达调控中作用及其生物功能提供了重要载体;进一步证实PSF为定位于细胞核的核蛋白。 相似文献
24.
25.
构建晚期糖基化终末产物受体(RAGE)胞外段不同功能段V/VC1真核细胞表达载体,并在前列腺癌细胞株PC-3中表达,为进一步研究其在前列腺癌发病中的作用和机制打下基础。方法 采用PCR方法扩增RAGE不同功能段V/VC1的序列,利用分子克隆技术将其重组于pcDNA3-HA载体中。利用PCR和测序鉴定克隆正确性。转染PC-3细胞,用Western-Blotting检测其表达,免疫荧光检测其在细胞中的定位。结果 克隆的RAGE不同功能段V/VC1真核表达载体完全正确,Western-Blotting检测到RAGE不同功能段V/VC1的表达,免疫荧光检测其主要定位于细胞浆中。结论成功地构建了RAGE不同功能段V/VC1真核表达载体,其能够在PC-3细胞中表达。 相似文献
26.
目的:构建高迁移率族蛋白B1(HMGB1)中细胞因子诱导片段1(CIF1)与串联亲和纯化(TAP)系统中纯化标签链霉亲和素结合肽(SBP)和钙调蛋白结合肽(CBP)序列相融合的原核表达载体,观察重组蛋白对小鼠单核/巨噬细胞白血病细胞释放肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响,为HMGB1参与炎症反应作用机制的研究以及CIF1结构域细胞膜表面受体蛋白的获得和鉴定奠定基础。方法:采用PCR方法分别扩增出cBP-SBP和CIF1的编码序列,构建表达质粒pET-14b/CBPSBP—CIF。利用Ni—NTA亲和树脂纯化融合蛋白,纯度达85%以上。采用纯化后的蛋白诱导小鼠单核/巨噬细胞白血病细胞RAW264.7,利用LiquiChip液相蛋白芯片系统检测RAW264.7细胞释放TNF-a的水平变化。结果:表达载体构建正确,CIF1重组蛋白表达量高,纯度好。当蛋白浓度大于0.5ng/μl时,CIF1重组蛋白诱导细胞TNF-α的分泌量与对照组相比差异具有显著性(P〈0.05),并且在CIF1蛋白浓度O~2.5ng/μl范围内,TNF-α的分泌量与CIF1重组蛋白的浓度呈显著的剂量依赖关系。结论:原核表达纯化了His—CBP—SBP—CIF1融合蛋白,该融合蛋白可以有效地作用于巨噬样细胞内的信号转导过程,介导了炎症因子TNF—α的分泌表达。 相似文献
27.
目的建立研究DNA-蛋白质相互作用的新方法。方法选择6只SPF级BALB/c小鼠,模型组经尾静脉注射脂多糖(LPS)25mg/kg,使平均动脉压(MAP)降至40mmHg(1mmHg=0.133kPa)造成内毒素休克,然后迅速处死,正常对照组同期处死,取肝脏组织。利用生物素一链亲和素系统结合磁珠分离技术筛选内毒素诱导基因(LIG)启动子的结合蛋白。用聚合酶链反应(PCR)扩增末端带生物素标记的LIG启动子探针,提取动物肝脏组织胞核蛋白,与制备的LIG启动子探针进行孵育,再以标记有链亲和素的磁珠分离LIG启动子-蛋白反应复合物,使用不同浓度NaCl洗脱结合的蛋白,使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)分离样品蛋白,并对凝胶进行银染显色,比较模型组与正常对照组的差异条带。结果两组胞核蛋白中共观察到15条差异条带。分析差异条带显示,与正常对照组比较,在低亲和力作用水平,LPS作用后有4个蛋白开始与LIG启动子作用力增强,而有1个蛋白则同启动子的相互作用减弱;在DNA-蛋白质高亲和力作用水平,则有9个蛋白因LPS刺激而同DNA的结合力增强,有1个蛋白同启动子的相互作用消失。结论成功建立了生物素-链亲和素结合磁珠分离技术的新方法,为研究DNA-蛋白质相互作用开拓了新思路,并从“转录调控组学”角度深入理解基因表达调控机制奠定了基础。 相似文献
28.
29.
目的构建人晚期糖基化终产物受体胞质内段(hRAGE-C)GST融合蛋白的重组原核基因表达载体并进行表达与纯化,研究其功能并鉴定与其相互作用的蛋白。方法采用PCR方法扩增hRAGE基因编码区的胞质内段,并将其重组于pGEX-KG载体中。重组质粒经PCR、酶切、序列鉴定分析后,转化大肠杆菌BL21,以异丙基β-D硫代半乳糖(IPTG)诱导产生hRAGE胞质内段的GST融合蛋白。结果PCR、酶切和测序结果表明所克隆的GST/hRAGE-C原核表达载体完全正确,继而表达、纯化获得了相对分子质量约35 000的融合蛋白(符合预期大小)。结论将hRAGE胞质内段构建于含有GST标记的载体上并获得融合蛋白的高效表达。 相似文献