荧光染色法测定重组酵母乙型肝炎疫苗原液中残留DNA的影响因素分析

目的: 对荧光染色法测定重组酵母乙肝疫苗原液中残留DNA的影响因素进行探索分析,以了解该方法对本疫苗残留DNA检定的适用性。方法: 参照探针杂交法对乙肝疫苗原液残留DNA的测定结果,对乙肝疫苗原液中可能存在Tween-20、PEG、蛋白等物质对荧光染色法测定残留DNA含量的影响进行分析,对该方法的线性范围、用于乙肝疫苗原液残留DNA检定的准确性和重复性进行了研究,并对不同来源DNA标准存在的差异进行比较。结果: 荧光法测定酵母乙肝疫苗残留DNA线性范围为2.5 ng.mL-1~80 ng.mL-1;发现Tween-20、PEG等对残留DNA检测影响较小,加标回收率均在80%-120%之间;而蛋白质对检测影响较大,经酚-三氯甲烷抽提后可有效去除蛋白质干扰,回收率达到90%左右,CV小于10%;同时发现不同来源的DNA标准品存在荧光标记效率的差异。 结论: 乙肝疫苗原液经处理去除蛋白干扰后可采用荧光染色法进行残留DNA含量的测定,但应注意使用与疫苗表达系统相同宿主来源的DNA标准品。     

重组乙型肝炎表面抗原(汉逊酵母菌表达)免疫小鼠后不同细胞免疫测定方法的比较研究

目的 探讨不同细胞免疫测定方法 对小鼠免疫乙型肝炎表面抗原 (HBsAg) 后细胞免疫应答测定的影响.方法 小鼠皮下接种 HBsAg,于免疫后 4、7、10、14 和 25 d 分离脾单个核细胞(MNC),应用酶联斑点法(ELISPOT) 测定 MNC 细胞体外刺激后所产生的细胞因子 IFN-γ斑点形成细胞计数(SFC),其中刺激物选择多肽和 HBsAg;流式荧光检测技术(Luminex)测定 MNC 体外经 HBsAg 刺激后所产生的细胞因子 IFN-γ、IL-4、IL-5 和 IL-10 含量;小鼠血清检测抗-HBs.结果 小鼠接种 HBsAg 后,应用 ELISPOT 法测定, 7 d 和 14 d 小鼠 IFN-γ阳转率分别为 60% 和 80%;而应用 Luminex 方法 测定,7 d 和 14 d 小鼠 IFN-γ阳转率均为 80%;IL-4、IL-5、IL-10 阳转率分别为 60%,80%;100%,100%;80%,100%;25d 时,IFN-γ与 14 d 比较统计学上差异有统计学意义( P25,14 d=0.030,＜0.05),而 IL-5、IL-10 和 IL-4 与 14 d 比较差异均无统计学意义 ( P＞0.05 ).抗-HBs 水平随时间而呈上升趋势.结论 Elispot 和 Luminex 法测定小鼠 IFN-γ应答符合率高,小鼠接种单针 HBsAg 后细胞免疫应答高峰为免疫后 7～14 d.25 d 时 IFN-γ分泌水平随抗-HBs 抗体水平升高而下降,而 IL-4、IL-5、IL-10 分泌继续保持较高水平.     

不同方法及载体转染神经干细胞的实验研究

目的利用不同的表达载体(阳离子脂质体及腺相关病毒rAAV-2-EGFP)转染神经干细胞,比较转染的效率,长期稳定性以及对神经干细胞活性的影响;再用不同转染方法(贴壁法及悬浮转染法)转染神经干细胞,比较转染的效率;为神经干细胞的标记以及进一步移植示踪寻找一种更为理想的方法。方法通过体外分离,培养孕12d胚鼠脑中神经干细胞,分别采用腺相关病毒与阳离子脂质体转染神经干细胞,于转染后36h,1周、2周、1月、6月采用荧光显微镜下计数绿色荧光细胞数目及比例,稳定表达后利用流式细胞仪检测稳定转染的效率,MTT法测定2种方法对神经干细胞增殖活性的影响,利用腺相关病毒转染对比贴壁法与悬浮法的转染效率。结果腺相关病毒转染后36h开始出现荧光,1周后转染效率为61.17%,明显高于脂质体转染的38.70%,并能长期稳定表达(6月),对神经干细胞的生长及增殖无明显的影响;悬浮法和贴壁法转染的效率分别为(60.1±3.5)%、(27.4±4.2)%,2组比较有显著性差异(P<0.05)。结论利用腺相关病毒及采用悬浮法转染神经干细胞是一种比较好的转染标记方法,适合干细胞移植后长期示踪检测。     

阿尔茨海默病APPswe/PS1△E9双转基因小鼠脑区中老年斑的分布

目的:观察老年斑在不同月龄的APPswe/PS1△E9双转基因小鼠脑区中的分布.方法:将雄性的杂合子小鼠与C57BL/6J雌鼠交配,所生的小鼠提取鼠尾DNA,PCR扩增目的基因.取鉴定为阳性的2.5、4.5、8月龄的杂和子小鼠各3只,进行Thioflavine S和Aβ免疫组织化学染色,观察老年斑的沉积.结果:共生产小鼠F1代39只,鉴定为阳性的有17只,阳性率为43.6%.组织学染色发现2.5月龄小鼠的脑区未见老年斑沉积,而4.5月龄及8月龄小鼠的皮质及海马可见老年斑沉积,并且随着月龄的增加,老年斑的数目增多,面积增大.结论:APP-swe/PS1△E9双转基因小鼠在4月龄时已有老年斑的沉积,为研究AD提供了很好的载体.     

铁在阿尔茨海默病APPswe/PS1△E9双转基因小鼠模型脑组织内的沉积

目的:研究铁在阿尔茨海默病(AD)APPswe/PS1△E9转基因小鼠脑区中的沉积情况以及与老年斑的对应关系,并探讨铁在AD发病机制中的作用.方法:将PCR鉴定为阳性的APPswe/SI△E双转基因4及8月龄小鼠为实验组,通过Thioflavine S,Perl's-DAB,Aβ免疫组化染色,观察铁在脑组织中的沉积并与同月龄野生型小鼠(对照组)对照比较.结果:实验组小鼠基底神经节处均见到铁的沉积,在皮质及海马处呈棕褐色沉积,其分布与老年斑的分布相类似;而对照组小鼠的皮质及海马未见铁的沉积.结论:脑内过多铁的沉积可能是Aβ蛋白在脑内聚集,从而形成老年斑的原因之一,提示铁鳌合剂疗法有可能成为治疗AD的一个新的靶点.     

急性一氧化碳中毒迟发性脑病的辅助检查

急性一氧化碳中毒后迟发性脑病（delayed encephalopathy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP）系指急性一氧化碳中毒经治疗清醒后，再过一定时间的“假愈期”，又出现一系列神经精神障碍。近年来本病发病率有逐年增高趋势，且伤残病死率很高。急性一氧化碳中毒后迟发性脑病国内发病率为10％～30％，国外为0．8%～43％。迟发性脑病可发生于急性一氧化碳中毒后3～240d。发病机制迄今尚不太明了。合理有效地检查有助于疾病的正确诊断和预后判断，现在就近年来相关的研究作一综述。     

118例癫痫患者卡马西平血药浓度监测结果及影响因素分析

目的 探讨癫痫患者卡马西平（CBZ）血药浓度的影响因素,为临床合理使用提供依据。方法 选取118例规律服用卡马西平治疗的癫痫患者作为研究对象,采用高效液相色谱法（HPLC）进行血药浓度监测,分析影响卡马西平血药浓度的因素。结果 75.42%的患者服用卡马西平后血药浓度控制在4~12 μg·mL^-1之间;性别因素、年龄因素对卡马西平血药浓度的影响不明显（P＞0.05）;联合其他抗癫痫药时,无效浓度比例较高,具有统计学差异(P＜0.05)。结论 服用卡马西平后,患者卡马西平血药浓度的个体差异大,尤其是合并使用其他癫痫药者。因此应避免联合使用,并积极监测患者药物浓度,实施个体化给药,促进安全合理使用。     

细胞免疫和遗传因素对乙型肝炎疫苗阻断母婴传播效果的影响

目的比较接种重组乙肝疫苗后不同体液免疫应答高危儿童的细胞免疫反应特点,进一步探讨母婴阻断失败、无应答的机理。方法124名母亲HBsAg和HBeAg双阳性的新生儿按常规乙肝的免疫程序接种重组CHO和酵母乙肝疫苗,于第1针免后3、7、12月检测HBsAg和抗-HBs,判定免疫成功或失败的新生儿,首针后60～120月(平均80月)再次检测HBsAg和抗-HBs指标,选取8名免疫重组乙肝疫苗母婴阻断失败儿童、4名免后无应答抗体反应的儿童和11名母婴阻断成功的儿童采集静脉血样,分离淋巴细胞,应用ELISPOT方法检测产生IL-2斑点形成细胞的数量,并对斑点数和表面抗体滴度的相关性进行比较,同时分析HLA-A、-B、DRB1和DQB1等位基因的多态性。结果(1)124名研究对象中有77．4％的儿童可产生保护性表面抗体,成功阻断母婴传播;13．7％的人免疫失败,感染乙肝;8．9％的儿童则对乙肝疫苗呈无应答状态。(2)免疫成功组产生IL-2细胞数(55．2±42．22)显著高于免疫失败组(3,75±3．24)和抗体无应答组(6．75±3．59),P<0．01。(3)儿童免疫乙肝疫苗后的表面抗体滴度与经乙肝疫苗诱导产生的特异性分泌IL-2的T细胞数量呈显著性正相关(r =0．601,P<0．01)。(4)HLA-B*48在对酵母乙肝疫苗无应答的儿童中占有25％的频率,显著高于免疫成功(2．2％)和失败的儿童(0％),P<0．05。对CHO疫苗无应答儿童的HLA-DRB1*15的频率显著高于免疫成功和失败的儿童(P<0．05)。结论乙肝疫苗母婴阻断失败和免后抗体无应答儿童的细胞免疫应答显著低于阻断成功的儿童,并且可能与遗传因素有关。